鸭肿头出血症病毒强毒的致病性及感染组织细胞的超微病理变化

将鸭肿头出血症病毒（DSHDV）强毒株以不同途径接种10日龄鸭胚，研究了病毒在鸭胚中的繁殖规律，并用透射电镜观察了感染鸭胚各组织器官的超微结构变化，同时用DSHDV人工感染不同日龄雏鸭，比较了不同感染途径对雏鸭的致病性和对不同日龄雏鸭的致病性。结果显示，尿囊腔和卵黄囊2种途径均能使病毒在鸭胚上繁殖并传代，对鸭胚的半数致死量分别为10^-7.24／0．2mL和10^-6.4／0．2mL。病毒感染鸭胚后，电镜下可观察到肝和尿囊膜中的病毒粒子，病毒粒子呈球形或椭圆形，大小为60～80nm，无囊膜；病毒在细胞浆内复制，可形成特征性包涵体；病毒侵害的主要靶器官为尿囊膜与肝，细胞器的变化主要表现为粗面内质网扩张以及线粒体肿胀和嵴断裂、消失。病毒经肌肉注射、口服和滴鼻均能使28日龄鸭感染发病，致死率分别为86％、89％和97％。研究表明，DSHDV能很好地在鸭胚上生长并致鸭胚各组织器官超微结构发生变化，不同感染途径均能使雏鸭感染发病且致病性强。     

草仙乙肝胶囊治疗慢性肝炎（湿邪困脾症）Ⅱ期临床研究

草仙乙肝胶囊是吉林省龙井制药厂根据南京中医学院附属医院治疗慢性乙型肝炎的经验方，经现代工艺加工研制而成的一种新.药该药具有清热解毒、健脾利湿之功效，主治慢性乙型肝炎，中医辨证属于湿邪困脾症．经临床试验，其效果显著，无毒副作用     

牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗(E2蛋白+C1株+HB01株)的研制与免疫效果评价

采用CHO细胞表达牛病毒性腹泻/黏膜病病毒1型（BVDV1）E2蛋白,采用杆状病毒重组表达牛病毒性腹泻/黏膜病病毒2型（BVDV2）E2蛋白,采用MDBK细胞微载体悬浮培养技术培养牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛副流感病毒3型（BPIV3）,收获蛋白表达产物和细胞培养物,经纯化、灭活后与605佐剂混合,制备牛病毒性腹泻/黏膜病(1型+2型)、牛传染性鼻气管炎、牛副流感(3型)三联灭活疫苗(E2蛋白+C1株+HB01株)。将疫苗免疫健康易感牛进行免疫效果评价,结果表明该产品免疫效果良好,免疫牛IBRV和BPIV3中和抗体效价均可达到1∶77以上;BVDV1和BVDV2 E2蛋白琼扩抗体效价均可达到1∶32以上;免疫牛攻毒保护率均可达到4/5以上。     

牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价

【目的】 研究牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）E0和E2串联基因重组腺病毒作为基因工程疫苗的应用潜力。【方法】 采用PCR扩增、E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒pDC316-E0-E2,将其与AdMax腺病毒系统的骨架质粒共转染HEK293T细胞包装成重组腺病毒,通过Western blotting进行验证,并通过Reed-Muench法测定病毒滴度,通过肌内、皮下免疫接种小鼠后用ELISA方法及流式细胞检测进行免疫效果试验。【结果】 成功扩增到E0、E2基因目的片段,大小分别为681和1 122 bp,得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测定其滴度为1.1×10¹⁰ PFU/mL;Western blotting检测结果显示,Ad5-E0-E2外源基因在HEK293T细胞中表达,得到了与预期相符的目的条带（65 ku）;ELISA检测结果表明,通过肌内和皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平;流式细胞检测显示首免、二免后肌内和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋比值均极显著高于PBS对照组（P<0.01）。【结论】 本试验成功构建重组腺病毒Ad5-E0-E2,且具有较好的反应原性和免疫原性,能诱导机体产生针对BVDV的特异性抗体。     

牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。     

雏番鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

从洛江区临床发病鸭分离到2株病毒,2株分离病毒能够致死鸡胚,能被Ⅰ型鸭病毒性肝炎标准强毒高免血清特异性中和。分离毒株在鸡胚上传代培养,并测定ELD50分别为10-6.32/0.2 m L、10-5.49/0.2 m L;经动物回归试验,对1日龄雏番鸭的致死率分别为80%和70%,雏番鸭出现明显的角弓反张姿态,剖检可见肝脏出血斑、出血点,为鸭病毒性肝炎的典型症状,表明分离到的病毒为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)。