一株猪源屎肠球菌的分离、鉴定及益生功能初步研究

从健康仔猪粪便中分离到一株乳酸菌ZW002,并从形态、生理生化指标,16S rRNA基因序列分析,鉴定该菌株为屎肠球菌(Enterococcus faecium),将其16S rRNA基因提交GenBank,登录号为JN542513。从耐酸、耐胆盐及抑菌性能等方面对菌株进行益生功能初步研究,结果表明,菌株ZW002表现出良好的耐受性及益菌性能,为猪用微生态制剂的研究开发奠定了基础。     

绵羊人工感染粪肠球菌的病理组织学观察

用粪肠球菌人工感染羔羊,复制粪肠球菌病病理模型。病理组织学观察可见病羊大、小脑有微血栓形成;大脑有噬神经和卫星化现象;肝细胞、肾小管上皮细胞变性、坏死、肾间质出血;脾脏的动脉周围淋巴鞘出现有许多上皮样细胞组成的上皮样细胞结节。结果表明,粪肠球菌引起羔羊出现的神经症状是非化脓性脑炎引起的,同时还伴随败血症变化。     

体外血脑屏障模型的构建及致脑膜炎粪肠球菌对其的影响

试验旨在探索致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障功能的影响，寻求稳定的构建体外血脑屏障损伤模型的方法。选用1周龄ICR小鼠进行原代脑微血管内皮细胞（BMEC）分离并通过BMEC特有的凝血因子Ⅷ（coagulation factor Ⅷ，Factor Ⅷ）进行荧光标记，鉴定分离的细胞并判定分离率。选用1~3日龄ICR小鼠分离星形胶质细胞并通过其特有的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）对进行荧光标记，鉴定分离的细胞并判定分离率。将原代细胞传至3代，用Transwell二维小孔分别构建单层BMEC和BMEC与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型。选用致脑膜炎粪肠球菌、非致脑膜炎粪肠球菌和大肠杆菌DH5α感受态细胞分别与构建的体外血脑屏障模型共培养，评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的穿透性。通过4 h渗透试验、荧光素钠通透性试验和血脑屏障损伤相关标志基因基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达量的检测，评估致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障模型的影响。结果显示，试验成功分离到BMEC和星形胶质细胞，纯度分别达90%和95%以上。细菌穿透试验结果显示，所选的3株细菌只有致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型。4 h渗透试验和荧光素钠通透性试验结果显示，共培养模型优于单层BMEC模型。与其他组相比，构建的体外血脑屏障与致脑膜炎粪肠球菌共培养组荧光素钠的穿透力更高，MMP-2基因的表达量明显上升。综上，BMEC与星形胶质细胞共培养的模型优于单层BMEC模型，致脑膜炎粪肠球菌可穿越体外血脑屏障模型，并介导体外血脑屏障损伤，本试验结果为揭示致脑膜炎粪肠球菌对体外血脑屏障损伤机制提供了理论依据。     

家蚕消化道来源蒙氏肠球菌的鉴定

研究了从家蚕消化道内分离出的4株肠球菌(C1、GC、FD、A20)的生理生化特征和16S rDNA序列,并与肠球菌种特异性探针序列进行了比较。生理生化特征测定结果表明,除A20外,C1、GC和FD与蒙氏肠球菌种的特征基本一致。由16S rDNA序列分析结果可知,分离菌株均与蒙氏肠球菌(Ent.mundtiiAJ301836)有高度同源性,在系统发育树内位于同一分支。分析肠球菌种特异性探针序列,分离菌株的16S rDNA含有与蒙氏肠球菌种特异性探针完全相同的序列。因此认为家蚕消化道内存在蒙氏肠球菌。     

J亚群禽白血病病毒与粪肠球菌混合感染的诊断及相关基因分析

为了解贵阳市某养殖场J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)gp85基因的变异情况及粪肠球菌(Enterococcus faecalis,EF)毒力基因的携带情况,本研究对该养殖场ALV与粪肠球菌混合感染的病例展开了病原学调查分析,采集病料进行病毒核酸检测、gp85基因克隆测序分析、核苷酸序列相似性分析、细菌分离鉴定、毒力基因检测等。结果显示,成功克隆出ALV gp85基因并分离鉴定出1株粪肠球菌,分别命名为GZM52021株和GZEF2021株。ALV核酸检测仅在约422 bp处出现特异性扩增条带,说明存在ALV-J感染;成功克隆ALV gp85基因,且GZM52021株与J亚群参考毒株gp85基因(GenBank登录号为KM655820、KF796654、JN378888和Z46390)的相似性较高,在97.9%~98.2%之间;gp85基因核苷酸序列遗传进化树构建结果与相似性结果一致。GZEF2021株在LB 固体平板上长出圆形凸起、不透明的乳白色菌落,在鲜血琼脂平板上有明显的溶血现象,革兰氏染色镜检为球形或卵圆形阳性链状球菌;16S rRNA测序结果显示,GZEF2021株与粪肠球菌(GenBank登录号为KJ626240、MT611693、KY399248、MH919370、MN379663和KU937389)的相似性均在99%以上;药敏试验结果显示,GZEF2021株对头孢哌酮、青霉素、哌拉西林和羧苄西林4种药物敏感,对复方新诺明、头孢拉定、头孢唑啉3种药物中度敏感,对新霉素、丁胺卡那、多西环素和米诺环素4种药物耐药;毒力基因检测显示,GZEF2021株携带有ace、gelE、asa1、EF3314和efaA 5个毒力基因,说明从鸡中分离出的粪肠球菌可能具有一定的致病性。该病死鸡存在J亚群ALV与粪肠球菌共同感染的情况,本试验结果可为了解J亚群ALV和粪肠球菌在贵州的流行趋势及其混合感染的诊治提供一定的参考资料。     

粪肠球菌生物被膜的研究进展

生物被膜是粪肠球菌致病机制的一个重要原因,临床上许多生物医学材料相关感染和某些慢性顽固性感染性疾病都与其密切相关。在生物膜中的细菌不仅耐抗生素,还可耐抗体的杀菌作用,严重危害动物以及人类的健康。对粪肠球菌生物被膜的历史、生物膜特性及作用进行了综述。     

新生仔猪口服屎肠球菌对其肠道菌群组成及化学屏障的影响

随机选择24头出生时间相近的健康杜×长×大外三元仔猪,分为2个组,每组3个重复;每个重复4头。分别在仔猪刚出生、3日龄及5日龄灌服10％灭菌脱脂奶（对照组）或含有屎肠球菌活菌（5×10。～6×10。CFU／mL）的10％脱脂奶重悬液（处理组）,每次2mL／头,仔猪25日龄断奶。记录哺乳期仔猪腹泻发生率。断奶当天屠宰仔猪,采集肠道内容物及黏膜样品,检测盲肠内容物主要菌群的数量、各肠段pH值和结肠内容物乳酸含量,用实时定量PCR检测空肠黏膜化学屏障相关基因的表达量。结果显示,屎肠球菌使仔猪盲肠的乳酸菌比率升高8．98％,致病性肠杆菌的数量和比例分别下降28．68％（P〈0．05）和13．01％,仔猪腹泻率也下降了43．21％,但不影响细菌总数和乳酸菌数量,也不影响肠道pH值、结肠乳酸含量以及空肠黏膜MUC2、pBD-1和PMAP-37mRNA的表达量,却显著下调LYSmRNA的表达。结果表明,口服屎肠球菌改善哺乳期仔猪肠道菌群组成,促进肠道健康,同时它对溶菌酶基因表达的抑制作用可能是维持乳猪肠道微生态稳定的重要因素之一。     

屎肠球菌微胶囊制剂的稳定性及对断乳仔猪生产性能的影响

本试验以自主筛选的一株屎肠球菌为对象,在抗逆性评估的基础上,通过微囊化提高耐热性和稳定性,并进行动物田间小试,评价其对断乳仔猪生长性能的影响。结果显示,通过优化保护剂与壁材的配方,改善喷雾干燥工艺参数,可使喷雾后获得的干物质中活菌数达到1010cfu/g;微囊化的屎肠球菌对高温的耐受性增强,贮存时间更久,对胃液和肠液依然具备较好的耐受性。在仔猪生长性能方面,与空白组相比,饲喂屎肠球菌组仔猪的平均日增重和日采食量分别提高37%和15%,料肉比和腹泻率分别下降16%和65%,说明该屎肠球菌微胶囊制剂可以改善仔猪生长性能。     

微囊化益生菌对小鼠急性溃疡性结肠炎的影响

试验旨在观察微囊化布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii,S.boulardii）与微囊化粪肠球菌（Enterococcus faecium,E.faecalis）对小鼠溃疡性结肠炎（UC）的治疗效果并探讨其作用机制。采用3%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfacte sodium,DSS）灌胃法制备小鼠UC动物模型,试验共分为6组,其中饮用DSS的小鼠随机分为5组：粪肠球菌菌粉组、微囊化粪肠球菌组、布拉迪酵母菌菌粉组和微囊化布拉迪酵母菌组给予不同的药物治疗,药物皆以溶液形式灌胃给药,UC模型小鼠（DSS组）每天饮用与药物等体积的生理盐水;正常对照组灌服与药物等体积的生理盐水。观察UC小鼠的症状和组织学变化,ELSIA检测血清中细胞因子（IL-6、IL-10与TNF-α）的含量,Western blotting检测小鼠结肠黏膜紧密连接蛋白（Occludin和Claudin-1）表达量。结果显示,与模型组相比,治疗后各益生菌组小鼠血清中TNF-α和IL-6含量均显著降低（P<0.05）,IL-10含量显著升高（P<0.05）,微囊化益生菌组小鼠髓过氧化物酶（MPO）活性及结肠损伤组织学评分（粪肠球菌粉组除外）均显著下降（P<0.05）,布拉迪酵母菌菌粉组与微囊化布拉迪酵母菌小鼠结肠黏膜内Occludin和Claudin-1表达量均显著升高（P<0.05）。粪肠球菌和布拉迪酵母菌可以缓解UC模型小鼠结肠炎症病变,且经过微囊化后的粪肠球菌和布拉迪酵母菌表现出更好的缓解小鼠急性溃疡性结肠炎病症效果,其机制与粪肠球菌和布拉迪酵母菌可以降低血清中IL-6与TNF-α含量,提高Occludin与Claudin-1的表达量密切相关。     

浣熊源粪肠球菌的分离鉴定与耐药性分析

为探究从四川某动物园1例病死浣熊肝脏中分离到的1株细菌的特性和耐药程度,本试验采用病原分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA测序、致病性试验、药敏纸片扩散法及耐药基因扩增的方法对该分离株进行了形态学及生化鉴定、致病能力和耐药程度分析。结果显示,分离株在普通LB培养基上呈现表面光滑、圆形凸起、边缘整齐、针尖大小的半透明菌落。经革兰氏染色在油镜下观察到蓝紫色球菌,测序结果与GenBank登录号为KY003107.1粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的同源性高达99.5%,形态学与生化鉴定特性与粪肠球菌特性相符。致病性试验表明,该菌可导致肝细胞肿胀、变性,具有一定的致病能力;药敏纸片和耐药基因扩增试验表明,该菌对14种常见的抗生素头孢西丁、头孢哌酮、头孢曲松、头孢吡肟、头孢噻肟、氨苄西林、卡那霉素、链霉素、奈替米星、丁胺卡那、阿奇霉素、红霉素、多西环素、四环素耐药,仅对万古霉素和庆大霉素中度敏感。四环素耐药基因tetC检测为阳性;tetM、tetA检测为阴性,氨基糖苷类耐药基因aac （6'）/aph（2″）检测为阳性,aph（3'）-Ⅲ、ant（6）-Ⅰ检测为阴性;大环内酯类耐药基因ermB检测为阳性,ermA、ermC检测为阴性;万古霉素耐药基因vanA、vanB和β-内酰胺类耐药基因TEM检测均为阴性。该试验从浣熊肝脏分离的粪肠球菌表现出多重耐药特性并具有一定的致病能力,结果可为动物园临床肠球菌感染的病例提供一定的药物选择参考,制定合理的感染防治方案。