斯氏艾美尔球虫肌动蛋白解聚因子在HeLa细胞中的表达

为真核表达斯氏艾美尔球虫(Eimeria stiedae)肌动蛋白解聚因子(ADF)基因,本研究采用RT-PCR技术扩增ADF基因,构建pVAX- 1-ADF真核重组质粒,并转染HeLa细胞.采用RT-PCR方法检测ADF mRNA转录水平、western blot检测ADF蛋白表达水平.琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR扩增出一条大小为350 bp的特异性片段,与预期值相符.Western blot检测显示,转染pVAX- 1-ADF的HeLa细胞在大约13ku处出现特异性表达条带,与预期值相符.本研究构建了E.stiedae ADF基因真核表达质粒pVAX- 1-ADF,并且在体外真核细胞中表达,为进一步寻找防治E.stiedae的疫苗候选基因奠定了基础.     

堆型艾美耳球虫生物学特性研究进展

鸡球虫病是一种严重危害养禽业的寄生虫病,其中堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)对鸡致病力较强,在各地养鸡场流行率较高,严重感染时可引起死亡,对鸡的生长发育和饲料转化率有较明显的影响。本文对E.acervulina的流行状况、形态特征、致病性、免疫原性等相关研究进行了综述,为兽医临床有效防治E.acervulina提供理论依据。     

柔嫩艾美耳球虫孢子化7小时卵囊中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因(Etmic-2)的 cDNA 序列,利用计算机设计出一对引物,从孢子化7h 卵囊中用 RT-PCR 技术扩增出1个片段(mic2～7h).把这个片段克隆到 pGEM-T-Easy Vector 中后,我们得到一个阳性克隆 pmic2～7h.酶切分析证明 pmic2～7h 含有 mic2～7h,并且外源片段以反方向插入 T 载体中.核苷酸序列测定结果表明 mic2～7h 比 Etmic-2基因至少长111bp.但这多出的111bp 并没有造成基因读框错位,也没有造成基因读框终止.这111bp 由2部分组成,一部分长42bp,另一部分长69bp.虽然这二个片段的3′端均有典型的真核生物 mRNA 内含子剪切信号,但5′端却没有内含子的剪切信号点.这说明多出来的111bp不是内含子序列,mic2～7h 基因也不是 Etmic-2基因的前体,而可能是 EtMIC-2的一种蛋白异形体基因.     

陕西省杨凌区柔嫩艾美耳球虫早熟株选育及致病性研究

采用球虫早熟系虫株选育的方法,反复收集感染后最先排出的卵囊,选育出杨凌地区鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株并对早熟株的潜伏期、致病性及繁殖能力进行了研究。结果表明,经18代选育的鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌早熟株的潜伏期比母株缩短了24h;早熟株卵囊的形态与母株相似,但没有母株卵囊的大;早熟株的繁殖能力低于母株,每羽鸡所排卵囊总量与剂量呈正相关,而每个卵囊的繁殖能力与剂量呈负相关;早熟株的致病性低于母株。     

鸡柔嫩艾美耳球虫特异性抗体EtMIC4-N蛋白BAS-ELISA检测方法的建立

为了检测柔嫩艾美耳球虫感染鸡血清中特异性抗体水平,原核表达纯化EtMIC4-N蛋白,采用免疫印迹法确定其反应原性,再以纯化后的蛋白为包被抗原,以生物素标记的羊抗鸡IgG为二抗,以HRP结合链霉亲和素为酶标抗体,建立了检测柔嫩艾美耳球虫抗体的BAS-ELISA方法。经检测,EtMIC4-N蛋白最佳包被浓度为7μg/mL,最适封闭液为1%BSA,最佳血清稀释度为1:80,二抗稀释度为1:100000,酶标抗体稀释度为1:100000,最适显色时间为15min,组内和组间变异系数均小于10%。通过动物感染试验验证,结果表明建立的BAS-ELISA可以用于检测柔嫩艾美耳球虫特异性抗体的检测,并且具有简便,快速,灵敏,成本低等特点。     

基于ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列兔肝球虫PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18S rRNA和28S rRNA进行序列比对分析,在18S rRNA 3’端和28S rRNA 5’端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列,其大小为1178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8S rRNA为155 bp,ITS2为600 bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列同源性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

毒害艾美耳球虫二次感染对雏鸡局部黏膜组织抗体生成细胞的影响

180只14日龄雏鸡随机分为毒害艾美球虫(Eimeria necatrix,E. necatrix)一次感染组、二次感染组和对照组。应用免疫酶组织化学染色法,对免疫相关指标进行了检测。结果发现,毒害艾美球虫二次感染雏鸡局部黏膜免疫组织的IgA、IgM、IgG生成细胞数量均不同程度的高于未感染毒害艾美球虫的对照组雏鸡,表明E. necatrix二次感染雏鸡局部黏膜组织的免疫功能明显增强。     

堆型艾美尔球虫的分离与病理学研究

采用单卵囊感染技术,从鸡球虫混合种中分离出一株堆型艾美尔球虫(Eimeria acenrulina).并对该株堆型艾美尔球虫的病理学做了进一步研究.利用堆型艾关尔球虫的寄生部位、肉眼病变、最小潜在期等生物学特性进行鉴定,并做回归试验,用此球虫卵囊1×105个感染雏鸡.取感染5d后有明显病理变化的十二指肠组织,采用石蜡切片技术,进行病理学观察.结果表明,虫体寄生于肠绒毛上皮细胞内,大量的肠绒毛遭到破坏、断裂和脱落.     

巨型艾美球虫gam56基因的截短原核表达及其产物的免疫保护效果

为评价gain56基因重组表达产物作为亚单位疫苗预防鸡巨型艾美球虫(E.maxima),感染的效果,以E.maxima NT株配子体总RNA为模板,RT.PCR扩增和克隆gain56基因,选择该基因两段丰富抗原表位的编码区片段.利用原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌中进行截短表达.以可溶性的GST-gain56-2融合蛋白为免疫原,设立高、中、低(1.0 mg、0.5 mg、0.25 mg)3个剂量,单独或使用弗氏完全佐剂,于5 d、12 d和19 d对雏鸡进行3次免疫,26 d用5 ×10~4个E.maxima孢子化卵囊进行攻虫,8 d后迫杀,对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率、ACI等指标进行统计分析.结果显示:就相对增重率而言各免疫组比未免疫攻毒组的高27.6%以上,而各免疫组之间差异不显著(p>0.05);就卵囊减少率指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度减少,但是均小于75%;就ACI指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度增加,以中剂量蛋白佐剂组为最高.GST-gam56-2融合蛋白对于E.maxima感染具有一定的免疫保护效力.