NaCl胁迫下黑麦草种子萌发过程中DNA甲基化与基因表达分析

为了解黑麦草（Lolium perenne）种子在正常条件与NaCl胁迫下萌发过程中DNA甲基化动态变化以及重要盐胁迫相关基因的表达。运用甲基化敏感扩增多态性技术分析对照和150 mmol·L^-1 NaCl处理下黑麦草种子萌发过程（0,1,2,4,7 d）的DNA甲基化水平及动态变化,并通过实时荧光定量 PCR（QRT-PCR）检测8个重要的盐胁迫相关基因的表达情况。结果表明：黑麦草种子萌发过程中甲基化水平呈下降趋势,以双链甲基化方式为主,甲基化变化同时发生在编码序列和非编码序列中。NaCl处理下DNA甲基化程度高于CK,而去甲基化程度低于CK,最终导致NaCl处理下基因组净的甲基化位点数目增加。黑麦草种子耐盐萌发过程中代谢增强,8个盐胁迫相关基因表达量呈上升趋势,而NaCl胁迫延缓了种子萌发进程,在大多数时间点的基因表达低于对照。     

松嫩草地羊草种子发育进程、休眠特性及与盐碱耐性关系的研究

羊草(Leymus chinensis)是禾本科赖草属根茎型优质禾草,不但营养价值高、适口性好,而且具有较强的耐旱、耐寒和耐盐碱性。羊草既是东北松嫩平原的优势种,也是干旱与半干旱地区建植人工草地的优良草种。近年来,随着畜牧业的发展及生态环境治理力度的加大,人工羊草草地不断建植,为此,人们对羊草种子的需求量与品质的要求也越来越高。本文通过研究羊草种子的发育进程、休眠特性及与盐碱耐性的关系,一方面明确羊草种子的最适宜收获时间,为农业生产上收获高品质羊草种子提供科学依据,另一方面挖掘羊草种子的发芽潜能、深入解析抗逆机理,为提高其利用率及抗逆新品种的选育提供理论基础。主要研究结果与结论如下:(1)通过对羊草种子发育动态的研究结果表明,羊草种子在发育过程中,随着成熟度的不断提高,种子的颜色由绿色变为浅绿色,再变成黄色,最后变为棕黑色。种子千粒重不断增加,在盛花后33 d达到最大值,之后趋于恒定。含水量与种子浸出液电导率则呈下降趋势,含水量在盛花后36 d达到最小值,而2个试验年份电导率值有所差异,分别在盛花后27和30 d达到最小值。标准发芽试验结果显示,羊草种子在盛花后39 d发芽率最高,此时种子的开始发芽时间、50%种子发芽时间、发芽势等指标均为最优。尽管加速老化试验的发芽指标与标准发芽试验略有差异,但是盛花后39 d的种子同样具有最强的抗老化能力。上述试验结果表明,盛花后39 d羊草种子活力最高,品质最佳,是种子最适宜的收获时间。 (2)不同成熟度的羊草种子对土壤埋深与盐碱胁迫具有不同的响应方式。羊草种子出苗与其后的幼苗生长能力随着种埋深度的增加而降低,1 cm是最适宜的播种深度,此时的出苗率最高、出苗时间最短,并且叶片与根系长度与生物量最大;另外不同成熟度的羊草种子表现出不同的出土成苗能力,盛花后39 d的羊草种子活力最大,其上述各项幼苗生长指标均为最优。种子的成熟度与盐、碱胁迫及其交互作用显著影响羊草种子的发芽率与发芽势,盛花后39 d的羊草种子在胁迫下具有最高的发芽率与发芽势,特别是在高浓度(400 mM)盐胁迫下,尤为明显。复萌试验结果显示,盛花后39 d的羊草种子在盐碱胁迫(特别是高盐环境)解除后同样具有最高的发芽率。上述结果表明,尽管不同成熟度的羊草种子均具有发芽能力,但是盛花后39 d的羊草种子出苗及抵御盐碱胁迫伤害的能力最强,这也进一步支撑了39 d是羊草种子适宜收获时间这一结论。另外羊草适宜浅播,1 cm是其最适宜的播种深度。 (3)通过人工手段处理可以明显打破羊草种子的休眠特性。研究结果表明,除了热水浸种处理外,其余方法如浓硫酸、冷层积、PEG,GA₃,KNO₃及清水浸种均能一定程度上提高羊草种子的发芽率,发芽速率、开始发芽时间及50%种子发芽时间。但是在生产实际中,既要考虑高效性也要考虑经济耗费,结合本试验的研究结果,我们推荐在生产中采用低温浸种20 d的方法来打破羊草种子的休眠,提高其发芽率。 (4)稃是抑制羊草种子萌发的重要因素,但同时也一定程度提高了种子的抗盐性。通过测定稃对羊草种子吸水、脱水、不同温度条件下的发芽响应以及不同持续时间盐胁迫对种子发芽的影响,结果发现稃可以显著提高羊草种子的吸水量,并同时减缓种子在干旱环境下的脱水速率,使种子不会过度脱水而死亡。稃、不同温度处理及两者交互作用显著降低羊草种子的发芽率与发芽速率,表明稃对羊草种子萌发具有一定的抑制作用。在不同持续时间的盐胁迫处理下,未萌发的带稃种子复萌率均高于去稃种子,特别是在长时间及高盐胁迫下尤为明显,表明稃对羊草种子耐盐性起着重要的调节作用,一旦雨水、融雪等条件降低了土壤盐浓度,带稃种子就可以继续萌发出土。 (5)20~30℃是羊草种子最适宜的发芽温度,高温、低温均显著降低种子的发芽率与发芽速率,并且此温度可一定程度上减缓盐胁迫与碱胁迫对种子发芽的抑制效应。随着盐、碱胁迫浓度的增加,羊草种子发芽率与发芽速率均呈下降趋势,且在碱胁迫下的下降幅度更大。在盐胁迫下,当盐浓度<200 mM时,低温是影响种子萌发的主要因素,随着盐浓度的不断增加,高温则更加剧了盐胁迫对种子萌发的抑制作用;而在碱胁迫下,即使碱浓度较低,高温与其交互作用也大大加剧了对种子发芽的抑制。盐胁迫下未萌发的羊草种复萌率随盐浓度增加而增加,而在碱胁迫下则随着碱浓度增加呈先上升后下降的趋势,高浓度碱胁迫使羊草种子失去活力而死亡,并且碱胁迫下种子的复萌率低于盐胁迫,25~35℃同样不利于种子的复萌。幼苗生长对温度与盐碱胁迫交互作用的响应方式与发芽阶段相似,20~30℃同样是最适宜温度;另外,盐碱胁迫均对羊草幼苗根生长的抑制作用更强。基于以上研究结果,我们建议在初夏(7月上旬),高降雨过后,温度与土壤条件适宜的情况下进行播种,以提高羊草种子的发芽率,更好的达到恢复退化草地的效果。 (6)在混合盐碱胁迫下,羊草种子的发芽率与发芽速率均随着盐浓度的增加不断下降,且碱性盐比例越大下降越明显。在250 mM盐浓度下,无碱性盐的A组处理发芽率为6.5%,而其余5组处理发芽率均为0。羊草幼苗生长阶段同样受盐浓度、pH及2者交互作用影响,并且根系对胁迫伤害更敏感,所受抑制作用更强。逐级回归分析结果表明,在种子萌发阶段,盐浓度是羊草种子在混合盐碱胁迫下能否萌发的决定性因素,而一旦胚根突破种皮进入幼苗生长阶段,pH就转变为主导因素。上述研究表明,混合盐碱胁迫对羊草种子萌发与早期幼苗生长阶段的抑制机理有所不同,其中高盐浓度与高pH的交互作用对种子萌发与幼苗生长的抑制效应最强。 (7)盐胁迫与碱胁迫均显著降低羊草幼苗的长度、鲜重与含水量,且碱胁迫抑制作用更强。2种胁迫均造成羊草幼苗Na⁺浓度与Na⁺/K⁺升高,并且K⁺浓度下降,但是在碱胁迫下,Na⁺ 浓度、Na⁺/K⁺上升幅度与K⁺下降幅度均大于盐胁迫。另外,在盐胁迫下,羊草幼苗大量积累Cl^-,有机酸含量变化不大;而在碱胁迫下,Cl^-,NO₃^-与H₂PO₄^-均呈下降趋势,而有机酸则大量积累,其中苹果酸、柠檬酸是主要的有机酸组分,可溶性糖是羊草幼苗在两种胁迫下共同的渗透调节物质。上述结果表明,碱胁迫由于具有高pH,对羊草早期幼苗生长的抑制作用更强,Cl^-与有机酸积累特征的差异表明羊草早期幼苗在盐胁迫与碱胁迫下具有不同的适应策略。     

老芒麦种子发育过程中的生理生化变化

在河北省承德市鱼儿山牧中国农业大学科技攻关实验站,以种植２年和３年的老芒麦为材料,研究种子发育过程中的生理化变化。结果表明,在老芒麦种子发育过程中含水量均呈先慢后快的阶段性下降,而干重则逐渐增加,种子在盛花期后２６～２７ｄ达到生理成熟,含水量为３９．０～４５．６％。可溶性粮含量随种子发育成熟逐渐减少,相反,淀粉含量则逐渐增加,生长素、赤霉素、脱落酸含量高峰在种子发育过程中出现的顺序不同。     

中国狗牙根染色体数变异研究初报

通过国内30份狗牙根种源当色体数目的观测分析.结果表明,①我国狗牙根种质资源染色体数目呈现非常高的异质性,不同种源具有不同染色体数,同一种源不同根尖存在不同染色体数,同一根尖不同细胞亦具备不同染色本数,不同倍性平均出现的频率依次为:4n(32.26%)>n(18.98%)>3n(10.7%)>6n(2.13%)>2n(0.41%).此外,非整倍体平均比率高达32.1%.②染色体数目与纬度、经度、海拔间均无显著回归关系.该项研究为我国狗牙根种质资源开发利用提供了初步的试验依据.     

亚洲1型口蹄疫病毒L蛋白缺失株的构建及其生物学定性

为确定口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白缺失对其生物学特性的影响,本研究在已建立的Asia1型FMDV反向遗传操作平台基础上,利用融合PCR方法缺失L蛋白基因编码区,构建了缺失L蛋白的重组Asia1型FMDV(rFMDV-ΔL)。拯救病毒的一步生长曲线结果表明,rFMDV-ΔL与亲本病毒相比在BHK-21细胞中的复制水平下降10倍,乳鼠毒力试验表明rFMDV-ΔL的毒力比亲本毒株下降6倍。另外,rFMDV-ΔL在BHK-21细胞上产生病变的速度明显变慢,形成蚀斑的时间延长,致乳鼠死亡所需时间也比亲本毒株明显延长。本研究是关于亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能研究的首次报道,为亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

蜂蟹螨(Varroa destructor)对福化利抗药性及其防治的研究

建立培养皿药膜法进行蜂蟹螨福化利(Fluvalinate)抗药浓度检测方法。分别以福化利浓度为0、12.5、25、50、100mg/L进行台湾5处蜂场蜂蟹螨抗福化利剂量调查,经回归分析,计算LC50之浓度介于23.75～79.25mg/L之间,比意大利抗性螨385～857mg/L仍低很多,显示抗药性尚未大幅增加。以隔落螨法防治蜂蟹螨平均每日可捕捉44.7～49.1只。比较隔落螨法、割雄蜂蛹加隔落螨法、蚁酸加隔落螨法、福化利防治法的效果,当蜂蟹螨密度不高时,可采用隔落螨法或加割雄蜂蛹方式进行防治,蜂蟹螨密度高时,可先以福化利、蚁酸进行1～2次防治,再配合隔落螨法,将可达到长期防治效果。     

不同饲用燕麦品种生产性能的综合评价

基于熵权赋权法,运用灰色系统理论中的灰色关联度法对26个燕麦品种的生产性能进行综合评价,结果表明,生产性能综合表现较好的是初岛燕麦、青永久409、青永久709及青永久316;青永久18综合评价值最低,生产性能最差,其余品种生产性能表现一般。经逐步回归分析,发现其中的绿叶数、叶长、茎叶比、鲜干比、生长速度、叶面积指数、相对生长速率及生长天数8个指标对饲用燕麦生产性能贡献显著。     

覆膜垄沟集雨种植对老芒麦高度和密度的影响

研究了北方农牧交错区垄沟集雨种植措施对老芒麦Elymus sibiricus生长发育的影响。覆膜垄沟集雨种植可以使有限降雨在沟内富集累加,垄面径流效率达到80%左右。老芒麦2008和2009年营养生长阶段,处理间高度差异显著。2008年处理1和CK相比,株高提高33.5%~61.3%;处理2和CK相比,株高提高20.1%~44.1%,处理1与处理2相比,株高提高9.2%~16.2%。2009年处理1与CK相比,株高提高93.2%~116.4%;处理2与CK相比,株高提高65.4%~82.3%;处理1与处理2相比,株高提高12.1%~19.4%。处理1、处理2与CK三者在密度方面差异不尽相同,总体表现出处理2和处理1老芒麦密度高于CK,2008年密度动态变化和单株分蘖数变化保持一致,2009年返青后,呈现出整体略微下降趋势,趋于稳定。     

辣蓼黄酮正丁醇部分体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

为明确辣蓼黄酮正丁醇部分（n-butanol part of flavonoids from Polygonum hydropiper L.,FNB）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PPRSV）的效果。本研究以Marc-145细胞和PPRSV弱毒疫苗毒株（TJM-F92）为对象,通过CCK-8法检测FNB对细胞的毒性作用,并检测先给药后接毒、先接毒后给药、药物与病毒同时作用这3种方式处理细胞后药物对病毒的抑制率。结果发现,FNB对细胞的最大安全浓度为500 μg/mL,因此,选择25~500 μg/mL浓度范围的FNB进行后续试验。各浓度的FNB处理病毒后,能不同程度的抑制PRRSV在细胞上的增殖,并呈现一定的剂量效应关系,药物的浓度越高,抗病毒效果越好。其中,先接毒后给药、药物与病毒同时作用这两种方式抗PRRSV效果显著,在25~500 μg/mL浓度范围内细胞存活率分别为21.55%~65.23%和24.85%~73.60%。而先给药后接毒,不能有效降低病毒的感染力,在药物最高剂量（500 μg/mL）时细胞存活率仅为7.00%,抗病毒效果不明显。FNB预先作用于Marc-145细胞虽未降低PRRSV感染细胞的能力,即药物对于PRRSV预防作用效果不理想,但是FNB对病毒感染细胞后呈现一定的作用,药物能够通过抑制病毒的合成、释放及直接杀灭病毒,进而能够有效抑制PRRSV在细胞上的增殖。本试验结果不仅为FNB在临床上治疗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供参考依据,而且可以为辣蓼的深度开发和利用提供理论依据。     

野蚕越冬卵的孵化和年发生代数的研究

研究证实(1980—1984年),嘉湖平原野蚕年发生三代.越冬卵始孵期为四月中旬,盛期为六月中旬.但近半个世纪以来.很多人一直误认为四月中旬发生的野蚕是第一代,六月下旬发生的为“第二代”,事实上都是越冬卵孵化的幼虫.均为第一代.经测定,四月下旬越冬卵孵化率为0.15%,5月下旬为7.9%,6日20日为91%.本区野蚕产越冬卵最的早在9月17日,高峰期在11月上旬.结束期在12月14日,越冬卵产出越早,翌年卵孵期也早,孵化的早和迟之间可相差122天.野蚕越冬卵翌年孵化期长的原因.与秋冬产卵期长及桑园生态环境复杂有关.据室内4月24日越冬卵孵化的幼虫连续饲养,到第三代卵期恰与室外第二代卵期相重叠,说明自然界发生第四代是可能的,但真正存活率在1%以下.在防治措施上,以在越冬卵孵化高峰期(6月15—20日)施用0.1%敌敌畏.防效最好.