碱性土壤基因组DNA的分离纯化和基因文库的构建

直接从广西南宁市凤凰纸业排污沟碱性土壤样品中抽提和分离纯化混合基因组DNA，所获得DNA的产量为每克土壤样品10～30pg。采用限制性内切酶EcoR1酶处理后，构建了以pGEM-3Zf( )为载体的DNA部分文库。文库的容量为23650个转化子。外源片段DNA平均大小为3．2kb。建库效率为每克环境样品获得6000个左右的含1～15kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和同源性比较，对从文库随机词取的16个转化子序列进行分析，发现13个外源插入片段包含序列尚未确定的DNA片段。     

柑橘体细胞杂种及其核质遗传研究进展

原生质体融合能够克服柑橘多胚、雌和／或雄性败育等生殖障碍，为柑橘(Citrus spp．)品种改良提供新的途径。柑橘原生质体融合主要采用“叶肉原生质体 胚性愈伤组织原生质体”和“胚性愈伤组织原生质体 胚性愈伤组织原生质体”两种模式，融合方式主要有对称和非对称融合。通过原生质体融合已获得200余个组合的体细胞杂种，杂种倍性多样，绝大多数为异源四倍体，其次为叶肉亲本型二倍体，此外还获得了一些其它倍性的杂种植株。体细胞杂种在柑橘品种改良上的应用主要是砧木改良和用作倍性杂交培育无核三倍体的亲本。柑橘体细胞杂种的鉴定方法有细胞学、形态学和遗传标记。柑橘体细胞杂种核质遗传研究表明，四倍体体细胞杂种核主要为双亲之和，二倍体体细胞杂种核来自叶肉亲本，叶绿体DNA表现出单向或单亲分离，在个别组合中有双亲叶绿体DNA共存现象；线粒体DNA主要来自悬浮系亲本，仅在少数组合中观察到重组或丢失现象。     

用于构建双价禽流感DNA疫苗的双目的基因表达质粒的构建及鉴定

为探索构建禽流感双价或多价DNA疫苗的可行性,本研究以本实验室前期研制的禽流感DNA疫苗p CAGGopti HA5为基础[其中含有禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang Dong/1/96(H5N1)的HA基因],将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因作为第二个目的基因,利用双启动子启动、内部核糖体进入位点(IRES)介导以及通过蛋白Linker编码序列连接融合表达两个目的基因的形式,构建了双启动子重组表达质粒pH5-eGFP、IRES介导的重组表达质粒pHIE以及融合表达重组质粒pH6E。并采用脂质体介导将这3种重组质粒分别转染293T细胞,通过间接免疫荧光试验和western blot方法检测HA和eGFP这两种目的蛋白的瞬时表达情况。结果显示,这3种重组质粒均能够正确表达AIV的HA蛋白和eGFP。其中pH5-eGFP表达出两个独立的目的蛋白,而且互相不影响各自的表达和细胞定位;pH6E则以融合形式表达两种目的蛋白,由于HA蛋白具有膜定位信号,所以融合蛋白主要定位于细胞膜上。本研究结果表明,双启动子表达质粒和双目的蛋白融合表达质粒适合用于构建AIV以及其他相关病原的双价DNA疫苗。     

玉米SLAF标记的开发及其在玉米果皮纤维素含量BSA分析中的应用

【目的】降低果皮纤维素是甜玉米品质改良的重要目标,然而玉米果皮纤维素含量调控的研究甚少,相关调控基因尚未定位。利用纤维素含量差异的重组自交系（RILs）群体,通过特异位点扩增片段（specific-locus amplified fragment-sequencing,SLAF）测序和分离混池分析（bulked segregant analysis,BSA）定位控制玉米果皮纤维素含量的染色体区段,鉴定调控玉米果皮纤维素含量的候选基因。【方法】以果皮纤维素含量显著差异的E327和G5-1为亲本,构建重组自交系（RILs）。对RILs群体进行果皮纤维素含量的测定,并根据纤维素含量的结果选择纤维素含量高、低的样本进行混池,用于SLAF标签的鉴定和BSA分析。在BSA分析中,首先对两混池和2个亲本DNA用HaeⅢ和Hpy166Ⅱ进行酶切,回收414-464 bp的酶切片段进行Illumina建库,并进行SLAF测序,然后根据多态性SLAF标签开发SNP标记,利用SNP标记对玉米果皮纤维素含量进行关联分析,鉴定调控甜玉米果皮纤维素含量的染色体区段。分析这些区段所包含的玉米基因,并找到它们对应的拟南芥同源基因,通过查阅拟南芥相关基因功能研究的文献,进一步鉴定控制玉米果皮纤维素含量的候选基因。【结果】两亲本和2个混池SLAF建库测序得到的SLAF符合预期,基于SLAF测序数据,鉴定了73 786个多态性SLAF标签,这些SLAF标签均匀分布在玉米的10条染色体上。在这些多态性标签中得到了523 395 SNP位点信息。通过关联分析,调控果皮纤维素变异的基因被定位到玉米基因组的6个染色区段,都位于玉米的第5染色体上。在这些区段上,一共有47个玉米基因。通过进一步的研究分析,在这些关联的染色体区段最终确定了9个候选基因。【结论】定位到调控玉米果皮纤维素的含量的基因,表明此方法可以用于基因定位。     

不同来源花生品种的ISSR分析及亲缘关系研究

利用13对ISSR引物对28个栽培种花生品种进行PCR扩增,研究这些品种的DNA多态性及其亲缘关系。结果表明,有7对引物检测到明显的多态性,从28个花生品种中扩增出90条带,其中多态性带达到79条,多态性比率为87.8%,平均每个引物可扩增出12.86条带,11.29条为多态性条带。品种间的遗传相似系数值在0.411~0.800之间,平均为0.620。在UPGMA聚类分析简单匹配系数值为0.57处,可把28个花生品种分成3个品种群。由此表明,这些不同来源的花生品种具有较高的DNA多态性,亲缘关系不同。     

拟南芥主动去甲基化研究进展

介绍了模式植物拟南芥主动去甲基化的最新进展,包括酶学过程、调控机制、去甲基化与甲基化平衡机制、研究方法及其生物学意义。这些进展对其他植物而言,除对调控机制可进行补充研究外,还对作物的重要经济性状,如育性调控、种子形成和抗逆基因筛选等的深入研究具有重要参考价值。     

三种土壤微生物总DNA提取方法的比较

本文对3种常用的土壤微生物总DNA提取方法Martin法、高盐改进法及试剂盒法进行了比较,并通过DNA得率、纯度及16S rDNA V3可变区的PCR扩增结合DGGE法（denatumg gradient gel electrophoresis）,分别对3种方法进行评价。结果表明,3种方法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求。其中试剂盒方法操作简单,提取的DNA质量较高,但DNA得率较低且成本昂贵。Martin法和高盐改进法用时较长,DNA得率较高,纯度较低,但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响,且成本低廉。     

甜菜DAMD-PCR体系的建立及优化

为了建立甜菜DAMD扩增体系,以期利用DAMD引物应用于甜菜品种指纹图谱的构建及分子标记辅助育种。本实验利用单因素变量的方法对甜菜DAMD体系进行优化。同时选用12个甜菜品种,利用优化的体系对25条DAMD引物进行扩增。获得甜菜的最适DAMD体系:总体积为20μL,包含模板DNA 10~80 ng、0.75 U的DNA聚合酶、0.2μL的d NTPs(2.5 mmol/L each)以及2.0μL的引物(10μmol/L)。同时25条引物均扩增出了清晰条带,除了个别引物多态性较差外,其余引物多态性都非常的丰富,其中引物62H(-)就可以把实验中用到的12个甜菜品种全部区分开。由此可见,DAMD引物的扩增效率很高,并且扩增结果稳定,条带清晰,非常适合甜菜品种指纹图谱的构建及遗传多样性分析。     

基于DNA池重测序技术的肉兔HSFs基因多态性分析

实验旨在研究肉兔热休克因子(HSFs)基因的遗传多态性并寻找耐热性相关分子标记。基于DNA池重测序技术获得SNPs数据,筛选HSF1(SNP1～SNP3)及HSF4(SNP4)上所有的错义突变,利用直接测序法对齐卡巨型兔、齐兴肉兔、加利福尼亚兔、四川白兔以及闽西南黑兔5个肉兔品种(系)共150个个体进行基因分型。结果发现:SNP1和SNP2完全连锁,SNP3呈假阳性,SNP1、SNP2及SNP4的遗传变异处于中等水平,且在群体间分布差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);SNP1的GG型与单倍型H3的分布与群体间耐热性能的高低一致,其中耐热性最好的四川白兔和闽西南黑兔在SNP1上为GG纯合体、优势单倍型为H3,耐热性次之的齐兴肉兔和加利福尼亚兔的优势基因型和单倍型分别为GG和H3,而耐热性最差的齐卡巨型兔则分别为GA和H2。以上结果表明,HSF1基因SNP1上的GG型及单倍型H3可能是肉兔重要的耐热分子标记。     

鱼类血液基因组DNA提取方法优化

The genomic DNA extracted from frozen whole blood of rainbow trout with methods of chloroform-potassium acetate, rapid genomic DNA extraction （RGDE） , improved RGDE, traditional phenol-chloroform and DNA reagent kit respectively, and detected by agarose gel electrophoresis. The results showed that mothode of improved RGDE can obtain better genomie DNA of fish. Then, the effect of extracting with improved RGDE methods were compared by ultraviolet spectrophotometric method with other mothods such as traditional phenol-chloroform from blood or muscle and DNA reagent kit from blood. The results showed that the average concentration of DNA extracted with method improved RGDE was 1 050 ng/μL, and was very significant higher than that by DNA kit or by phenol- chloroform, and the average output of DNA was 1 575μg/mL, and the rate of A260/A280 was between 1.65 - 1.97. It only spent 2 hours to extract DNA with the method of improved RGDE, and there were many obvious merits such as quick speed, low cost, no pollution and no using specific installations and so on, and to amplify by random primers, the rusuhs was stable,and the electrophoresis banding was clear.