猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

Construction and Characterization of Grass Carp （Ctenopharyngodon idellus） Fosmid Library

Grass carp （Ctenopharyngodon idellus） genomic fosmid library cotaining 129 014 clones was constructed and characterized from one diploid grass carp. The average insert size of the fosmid library was determined to be 35 kb by pulsed field gel electrophoresis, which is 4.1-fold coverage of the grass carp genome. To demonstrate the probability of picking the functional genes from the library, eleven functional genes were screened by three-dimensional PCR technique. The number of positive clones of these genes was from 1 to 6. So, this library may screen any useful genes from grass carp. This grass carp genome fosmid library will be integrated in the presently ongoing efforts to determine the sequence of the grass carp genome.     

贝类单孢子虫荧光定量PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。     

基于多重串联式PCR的基因碟片技术检测转基因作物

【目的】建立基于多重串联式PCR（multiplexed tandem PCR,MT-PCR）的基因碟片技术,并使之应用于转基因作物的大量、快速和稳定地检测。【方法】以转基因作物研究中常用的调控序列NOS终止子、FMV35S启动子及外源基因NPTⅡ、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、CP4-EPSPS、PAT和玉米内源基因IVR、棉花内源基因sad1、菜籽粕内源基因PEP为检测对象,针对每个基因设计内外2对引物,先进行一次循环数较少（10-20 cycles）的高通量多重PCR,以便在均匀地扩增各基因和调控序列的同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因和调控序列,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。【结果】该方法能够快速（＜2 h）、高通量、准确地（＞0.000292 ng）检测出棉花、玉米、大米、菜籽粕中的多种转基因成分,可以分辨出3种转基因物种,适合大批量检测。【结论】该方法适合转基因作物的高通量、定量检测,具有较好的应用前景。     

GA含量与其合成酶基因在‘长富2号’苹果及其短枝型芽变品种之间的比较分析

【目的】研究苹果枝条节间长度与内源激素赤霉素（GA）水平及GA合成关键酶基因序列和表达之间的关系,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】以‘长富2号’苹果及其短枝型芽变‘龙富短枝’的枝条和叶片为试材,通过对花后4个时期GA含量的测定及GA合成途径中关键基因的克隆及表达,研究枝条生长过程中GA与枝条节间长度的关系。【结果】在花后80 d,GA含量在非短枝型苹果及其短枝型芽变中差异显著,短枝型芽变品种中GA含量低于非短枝型品种。序列分析表明,GA合成关键酶基因GA20-氧化酶（GA20ox）和贝壳杉烯氧化酶（KO）的cDNA序列在‘龙富短枝’和‘长富2号’中完全一致,无碱基的突变、插入或缺失现象发生。实时荧光定量PCR分析表明,在花后20 d和80 d,GA20ox和 KO的相对表达量在‘龙富短枝’和‘长富2号’之间差异显著,短枝型芽变品种中的相对表达量显著低于非短枝型苹果。【结论】GA含量差异和GA合成关键酶基因差异表达与短枝型苹果枝条节间长度相关联,低GA含量和GA合成关键酶基因的下调表达抑制了苹果枝条的伸长。     

小苍兰3种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus (FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumubermosaic virus (CMV)和菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus (BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测小苍兰3种病毒的多重PCR检测体系.该体系能够一次扩增出FreMV,CMV和BYMV的特异片段,其大小分别是340、628和212 bp.测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达97％以上.灵敏度测定结果表明,从≥10-2mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒.     

自然感染鲤疱疹病毒Ⅱ的病毒载量研究

通过建立靶向于鲤疱疹病毒Ⅱ(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)胸苷激酶基因(TK基因)的荧光定量PCR法,分别检测了自然感染Cy HV-2的金鱼、鲫样品,并结合人工感染试验,分析了脾和肾组织内Cy HV-2的载量及其引发的组织病理变化。结果表明,自然感染Cy HV-2的金鱼和鲫的病毒拷贝数范围为102~105,人工感染Cy HV-2的异育银鲫在感染后第五天脾和肾组织内病毒的拷贝数高达1010。人工感染条件下鱼体呈现系统性病理损伤,自然感染状态下鱼体脾和肾的病理变化分别表现为细胞嗜性的转变和炎症。     

不同保存方法对武汉单极虫DNA提取和PCR扩增的影响

为探讨不同保存方法对武汉单极虫Thelohanellus wuhanensis DNA提取和PCR扩增的影响,将从患武汉单极虫病的异育银鲫Carassius auratus gibelio鱼苗上分离出含有孢子的孢囊,分别置于100%乙醇、70%乙醇、2.5%戊二醛、10%福尔马林、Bouin's液、Carnoy's液和Müller's液中保存50 d,经计数调整孢子等量后分别进行DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增。结果表明:100%乙醇和70%乙醇保存方法对武汉单极虫孢子DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增均无任何影响,等同于新鲜孢子,可作为孢子的保存方法;2.5%戊二醛和Bouin's液保存方法只对孢子DNA提取有影响,但均能在常规PCR和巢式PCR扩增后出现特异电泳条带,可作为用于常规PCR和巢式PCR扩增的孢子保存方法;10%福尔马林和Müller's液保存方法对孢子DNA提取和常规PCR扩增均有影响,但均能在巢式PCR扩增后出现特异电泳条带,故只能作为用于巢式PCR扩增的孢子保存方法;Carnoy's液保存方法无论在孢子DNA提取还是进行常规PCR和巢式PCR扩增均无阳性结果,故不能用作孢子核酸分子生物学研究的保存方法。研究表明,除100%乙醇和70%乙醇保存方法外,其他保存方法对孢子DNA提取、常规PCR和巢式PCR扩增均有不同程度的影响。     

王浆主蛋白MRJP7基因在意大利蜜蜂(Apis melliferaligustica Spinola)体内的表达

王浆蛋白是蜂王浆生物功能的物质基础,是由王浆蛋白基因家族(mrjps)编码合成的。但部分家族成员如MRJP7在王浆中的含量极少甚至检测不到。基因功能与其在生物体内的时空表达特性相关,为探究蜂王浆中含量较少的王浆主蛋白基因mrjp7在蜜蜂体内的表达和生物学功能,本研究利用荧光定量PCR技术对mrjp7在不同发育时期的工蜂和、成年工蜂、雄蜂和蜂王的不同发育时期和不同组织部位的表达进行定量分析检测。结果显示mrjp7在成年雄蜂体内的表达水平最低,成年蜂王次之,且在这两种蜜蜂类型它们的各不同发育时期和不同组织部位之间的表达量差异较小,其表达基本没有时空特异性。该基因在工蜂幼虫和蛹期的表达量同样较低且没有组织特异性,但在羽化后9日龄前后的哺育蜂王浆腺和头部脑组织内特异性高表达,其表达与工蜂的发育时期和组织密切相关。mrjp7在这与哺育蜂分泌蜂王浆王浆腺中的特异性高表达与哺育蜂所担负的哺育幼虫和蜂王的功能是相适应的,该结果在转录水平上证实了mrjp7该基因的的营养功能,为进一步的研究和应用打下了理论基础。。其在生殖和非生殖蜜蜂体内的差异表达可能与蜜蜂的生殖调控有关。     

蛙携带虹彩病毒的分子流行病学研究

运用多重实时PCR对多地的养殖和野生蛙类携带虹彩病毒的本底展开调查,并进行病毒分型。结果表明,检测的样品平均阳性率为8.90%,养殖蛙的平均阳性率为4.57%,野生蛙的平均阳性率为16.82%。从蛙种类来看,养殖牛蛙和黑斑蛙带毒率较低,而养殖的棘胸蛙和野外捕捉的斑腿树蛙带毒率较高。不同蛙携带的蛙病毒的分子序列比较结果显示,不同来源的蛙病毒高度保守,缺乏明显的宿主与地域特异性,表明人工繁育场暴发虹彩病毒可能对其他野生蛙类资源产生了负面影响,建议在野生动物人工驯养繁殖体系中引入病害监测和疫病防控措施。