Effect of dietary Clostridium butyricum and different feeding patterns on growth performance,antioxidant and immune capacity in freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii)

An 8‐week study was conducted to evaluate the effects of different feeding patterns with dietary Clostridium butyricum supplementation on growth performance, antioxidant and non‐specific immune responses in freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (0.39 ± 0.001 g). There were four feeding methodologies: feeding basal diet continuously (P1); feeding diet with 500 mg/kg C. butyricum continuously (P2); feeding diet with 500 mg/kg C. butyricum 5 days after 2 days of basal diet (P3) and feeding diet with 500 mg/kg C. butyricum 2 days after 5 days of basal diet (P4). The results revealed that prawns in P3 had the highest weight gain rate (WGR) and lowest feed conversion ratio (FCR) than the other groups. Haemolymph total protein levels and superoxide dismutase activity increased significantly in P2, P3 and P4 groups, while malondialdehyde content and anti‐superoxide anion levels decreased significantly compared to control. The mRNA expression of intestinal dorsal and Toll in P2 and P3 groups decreased significantly compared to control. Prawns in P3 exhibited improved growth performance, increased antioxidant capacity and enhanced immune function. We concluded that feeding diet with 500 mg/kg C. butyricum for 5 days after 2 days of basal diet was recommended for M. rosenbergii.     

多重聚合酶链反应检测环境中产气荚膜杆菌

产气荚膜杆菌根据产生4种主要毒素（α－β、ε、τ－毒素）可分为5种类型A－E型。在该研究中依据产气荚膜杆菌的5种毒素基因的序列，设计了5对PCR引物，建立了多重PCR方法，该方法可以快速区分5种类型的产气荚膜杆菌。并对68份环境样品（生活污水、生物肥料）进行检测和基因分型，共检出55株产气荚膜杆菌，其中A型产气荚膜杆菌50株，占总数的90％以上，B型、C型、D型只占5％，未检出E型产气荚膜杆菌，所有的分离株没有发现带有肠毒素。结果表明，目前环境中主要存在的菌型为A型菌，其他菌型的产气荚膜杆菌很少，而多数是非致病性产气荚膜杆菌。     

3种诱饵材料对C型肉毒梭菌外毒素灭鼠效果的研究

为了提高C型肉毒梭菌外毒素燕麦毒饵的采食率和灭鼠效果,对韭菜、葱和白菜3种诱饵材料的添加效果进行研究。结果表明:3种诱饵材料均在一定程度上起到了提高毒饵采食率的效果,其中韭菜的诱导效果最佳,采食率和灭洞率较对照分别提高了34.7%和12.5%,较白菜分别提高了29.4%和5.4%,较葱分别提高了17.0%和5.5%。     

猪源艰难梭菌的分离鉴定及特性分析

为了解河南省规模化猪场猪源艰难梭菌的流行、耐药以及毒素基因携带情况,收集来自豫西地区5个养殖场中疑似艰难梭菌感染(clostridium difficile infection,CDI)猪的粪便标本(n=41)。采用厌氧培养法,用艰难梭菌选择性培养基环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(cycloserine-cefoxitin-fructose agar,CCFA)完成分离培养。采用表型培养法进行菌株分离和鉴定,以多重PCR同时鉴定菌株并检测tcdA和tcdB毒素基因及二元毒素编码基因cdtA和cdtB。采用E-test法检测艰难梭菌对常用抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值并判定菌株对药物的敏感性。结果从分离的41份样本中,经染色镜检及PCR鉴定,分离出符合艰难梭菌生长特性的菌株1株。药敏结果显示分离菌株对万古霉素和甲硝唑呈现高度敏感,对氟喹诺酮类药物以及四环素等表现出不同程度的耐药。艰难梭菌的研究大多集中在人源方面,本研究首次在河南省规模化养猪场中分离出艰难梭菌,对所分离菌株进行毒素基因检测,毒素A、B呈阳性,而无二元毒素基因。分离的猪源艰难梭菌对红霉素、万古霉素、甲硝唑、利福平均呈现高度敏感,对克林霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、利奈唑酮和青霉素呈现不同程度的耐药。     

产气荚膜梭菌α毒素C末端的三拷贝串联表达与免疫原性分析

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素（CPA） C末端（第247－370位氨基酸,CPA_C）三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因（GenBank登录号：AY823400.1）进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因（GCPA_C3）,片段之间用柔性氨基酸linker （GGGS）连接,经人工合成后克隆至原核表达载体pET-30a （＋）中进行表达与纯化,获得CPA_C的三拷贝重组蛋白（rCPA_C3）。利用Western blotting方法检测rCPA_C3与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。将rCPA_C3与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔最低致死剂量（MLD）的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_C3对家兔的免疫保护效果。结果显示,rCPA_C3主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;每毫升的一免抗血清可中和30~50个、二免抗血清可中和70~100个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。采用1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%（4/4）死亡,免疫组得到了100%（4/4）的保护。以上结果说明,rCPA_C3具有良好的免疫原性,为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡生长性能和肠道健康的影响

本试验旨在研究饲粮中添加枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡生长性能和肠道健康的影响。选用480只1日龄肉公鸡(Ross 308)随机分为5组,分别为对照组(CON组)、产气荚膜梭菌攻毒组(CP组)、CP+10 mg/kg恩拉霉素组(ENRA组),CP+10 mg/kg枯草芽孢杆菌(1010CFU/g)组(BS组)和CP+5 mg/kg恩拉霉素+10 mg/kg枯草芽孢杆菌组(ENRA+BS组),每组8个重复,每个重复12只,试验期42 d。所有攻毒组肉鸡在第14天时口服混合型艾美尔球虫悬浮液[11 000孢子/(mL·只)],第16～18天时口服产气荚膜梭菌悬浮液[108CFU/(mL·只)]。结果表明:1)与CP组相比,ENRA组、BS组和ENRA+BS组肉鸡第1～21天料重比有降低的趋势(P=0.051);与CON组相比,ENRA组和ENRA+BS组肉鸡第1～42天料重比显著降低(P<0.05)。2)与CP组相比,ENRA组、BS组和ENRA+BS组肉鸡第28天空肠病变计分极显著降低(P<0.01)。3)第21天和第42天时,ENRA组隐窝深度极显著低于CP组、BS组和ENRA+BS组(P<0.01)。第42天时,与CP组相比,ENRA组绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)显著增加(P<0.05),BS组和ENRA+BS组VH/CD有提高趋势(P>0.05)。4)第21天时,与CP组相比,ENRA+BS组空肠黏膜分泌型免疫球蛋白A (SIgA)含量显著增加(P <0.05);第28天时,与CP组相比,BS组和ENRA+BS组空肠黏膜免疫球蛋白G (IgG)含量显著增加(P<0.05)。5)与CP组相比,ENRA组、BS组和ENRA+BS组第21天肉鸡大肠杆菌数量极显著降低(P<0.01); ENRA组、BS组和ENRA+BS组第28天肉鸡产气荚膜梭菌数量极显著降低(P<0.01)。由此得出,枯草芽孢杆菌可在一定程度上改善肉鸡肠道健康和生长性能,当与恩拉霉素(5 mg/kg)合用时,其效果更好,从而起到减少抗生素使用的作用。     

产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析

为获得具有与β毒素蛋白相同免疫原性的新蛋白,本研究对产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列进行综合分析,预测其抗原表位并筛选出有效的新蛋白。采用生物信息学方法综合分析β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、跨膜区域以及信号肽,同时参考ElliPro服务器在线预测。最终预测aa108～aa320区段为优势抗原表位,在此基础上建立β毒素蛋白三维结构模型,标记特殊位点并筛选出B型产气荚膜梭菌新蛋白(CPB-N)。诱导表达CPB-N后通过SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示在约24 ku处有明显条带。采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,结果表明CPB-N与β毒素蛋白的免疫原性基本相同。CPB-N蛋白的筛选及预防产气荚膜梭菌引起的疾病奠定了重要的研究基础。     

发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能和肠道健康的影响

试验以产气荚膜梭菌感染肉仔鸡建立坏死性肠炎模型,研究发酵乳杆菌和凝结芽孢杆菌对感染肉鸡生长性能和肠道健康的影响。将336只1日龄爱拔益加肉仔鸡随机分成4个处理组,每个处理6个重复。4个处理组分别为对照组、感染组、感染＋LF组（日粮添加1×10⁹ CFU/kg发酵乳杆菌）、感染＋BC组（日粮添加1×10¹⁰ CFU/kg凝结芽孢杆菌）。所有感染肉鸡在14~21 d经口接种A型产气荚膜梭菌。试验期为28 d。结果显示：与对照组相比,灌服产气荚膜梭菌显著降低22~28 d肉鸡的日均采食量（P<0.05）,显著增加28 d十二指肠和空肠损伤评分（P<0.05）,显著提高21 d肉鸡盲肠的产气荚膜梭菌和大肠杆菌数量,显著降低28 d回肠产气荚膜梭菌数量（P<0.05）。与感染组相比,日粮添加发酵乳杆菌显著提高21 d肉鸡回肠的乳杆菌属数量（P<0.05）,显著降低21 d盲肠大肠杆菌的数量（P<0.05）;日粮添加凝结芽孢杆菌显著降低28 d肉鸡十二指肠损伤评分（P<0.05）,显著降低21 d十二指肠隐窝深度（P<0.05）,显著提高21 d空肠绒毛高度与隐窝深度的比值（P<0.05）,显著降低21 d肉鸡回肠和盲肠的大肠杆菌数量（P<0.05）,显著提高28 d肉鸡回肠乳杆菌属数量（P<0.05）。综上所述,日粮中添加发酵乳杆菌或凝结芽孢杆菌均对感染肉鸡的肠道微生物具有调控作用;其中添加凝结芽孢杆菌有利于肠道绒毛发育,缓解肠道损伤,一定程度上提高了肉鸡的生长性能,而发酵乳杆菌没有缓解肠道损伤的作用。     

产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建

以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒.