肽聚糖对肉制品中产气荚膜梭菌芽孢萌发率影响及预测

该研究利用产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)营养体及其芽孢肽聚糖以芽孢萌发率S、浑浊度OD600%、Ca^2+-DPA%变化率等为指标比较不同肽聚糖对C.perfringens芽孢萌发的影响;并针对芽孢萌发率检测耗时、费力等问题,提出一种基于近红外光谱技术(near infrared spectroscopy,NIR)定量预测不同浓度肽聚糖诱导芽孢萌发率研究。首先原始光谱经不同方式预处理,获得最佳方法为标准正态变换,然后使用主成分分析和遗传-联合区间偏最小二乘法进行光谱数据降维及特征变量筛选,分别对不同浓度肽聚糖诱导芽孢S、OD600%、Ca2+-DPA%进行快速预测。结果表明:营养体肽聚糖可有效诱导芽孢萌发,而芽孢肽聚糖效果不明显。利用GA-siPLS筛选芽孢萌发特征变量的最佳特征区间分别是[3,9,11,14]、[1,7,12,15]和[7,8,12,17],其预测集R和RMSEP分别为0.8726,0.8611,0.8841和0.769,0.218%,42.34%。研究结果表明,利用NIR结合GA-siPLS可定量预测肽聚糖诱导C.perfringens芽孢的萌发率,实现芽孢萌发的快速预测,为保证肉制品安全提供有效手段。     

Effect of Inoculation with Anaerobic Nitrogen-Fixing Consortium on Salt Tolerance of Miscanthus sinensis

A functional community of bacterial endophytes, an anaerobic nitrogen-fixing consortium (ANFICO), was previously isolated from grasses. In the present study, we investigated another function of ANFICO. The grass Miscanthus sinensis was inoculated with an ANFICO that included Clostridium sp. Kas201-1 and Enterobacter sp. B901-2 and was more tolerant to salinity stress than uninoculated or B901-2-inoculated plants. Microscopic observations using an immunostaining technique revealed the presence of endophytic colonization by the clostridia and the maintenance of a substantial clostridial population until the end of plant cultivation. We conclude that endophytic Clostridium sp. Kas201-1 accompanying Enterobacter sp. B901-2 enhances the salinity tolerance of the host plant.     

CO一步法C. autoethanogenum发酵产乙醇的工艺研究

合成气/CO发酵制备燃料乙醇是一项具有吸引力的新技术,为促进C.autoethanogenum在该技术中的应用,对C.autoethanogenum的乙醇发酵工艺及过程参数进行了研究。结果表明,C.autoethanogenum代谢木糖的产物以乙酸为主,只产生少量乙醇;与无机氮源相比较,C.autoethanogenum在含有机氮源的培养基中生长迅速,菌体浓度高。在3 L发酵罐中进行C.autoethanogenum的批式发酵试验,采用木糖生长-CO发酵两步法,乙醇主要在CO发酵阶段产生,最高乙醇质量浓度为1.71 g/L;发酵罐经改进之后,采用CO一步法发酵,虽然得到的菌体浓度降低了,但是发酵时间延长,最高乙醇质量浓度达到7.36 g/L,而乙酸质量浓度在整个发酵过程中均低于1.1 g/L。此外,研究发现发酵液的pH值和氧化还原电位ORP与乙酸/乙醇产物分布密切相关,尤其是pH值。上述研究结果可为C.autoethanogenum发酵CO生产乙醇的中试放大提供参考。     

重组C型肉毒梭菌毒素的表达与免疫保护性分析

本研究旨在获得重组C型肉毒梭菌毒素蛋白,并评价其免疫保护性。将麦芽糖蛋白（MBP）和C型肉毒梭菌毒素重链C末端（CH_C）的编码基因序列进行优化和串联,获得基因片段GMBPCH_C。将GMBPCH_C克隆至pET28a-（＋）后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,分别在15和37℃两种温度条件下诱导表达。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的目的蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rMBPCH_C。将rMBPCH_C与Montanide ISA 201佐剂混合制备成疫苗,免疫4只家兔,剂量为100 μg/只。根据《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测一免后21 d及二免后14 d家兔血清的中和抗体效价。同时,在二免后14 d对家兔进行攻毒。结果表明,rMBPCH_C在37℃的诱导温度下,主要以包涵体的形式表达;在15℃的诱导温度下,可溶性表达的比例可达50%。一次免疫后,免疫组4只家兔血清对C型肉毒梭菌天然毒素（简称天然毒素）的中和效价均可达到1（0.1 mL血清中和1个小鼠最小致死量（MLD）的天然毒素）。二免后,家兔血清的中和抗体效价可达到4~8。用10个家兔MLD的天然毒素攻毒后,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护,而用1个家兔MLD的天然毒素攻毒后,对照组家兔100%（2/2）死亡。以上结果说明,rMBPCH_C具有良好的免疫原性,从而为C型肉毒梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的定点突变与表达

选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变,构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。利用PCR定点突变技术,进行第68位组氨酸→亮氨酸的定点突变,构建含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果表明,α毒素突变基因第287位核苷酸由A→T,经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因,且基因序列和阅读框架正确;重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的33.82%。因此,已成功构建了α毒素基因突变体,并实现了在重组大肠杆菌中的表达。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的测定与分析

[目的]研究C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的遗传变异特点。[方法]设计产气荚膜梭菌α毒素基因特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考序列通过DNAStar软件进行同源比对。[结果]序列分析表明,所测菌株α毒素基因核苷酸组成中腺苷酸含量较高,胞苷酸含量较低。所测菌株与13、C57-1、CER 89L43、S01、S08、T01以及T16菌株的核苷酸序列同源性分别为98.7%、98.7%、98.6%、98.8%、98.7%、97.0%、98.6%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.6%、98.6%、98.9%、98.9%、98.9%、98.6%、98.6%。[结论]所测C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考序列同源性均较高。     

热纤梭菌内切β-1,4-葡聚糖酶的克隆与表达

将来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)A TCC 27405的编码内切β-1,4-葡聚糖酶的结构基因(eelD)与热激表达载体pHsh连接,得到重组表达载体pHsh-celD,并将重组表达载体pHsh-celD转入到大肠杆菌Eseheriehia eoli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中.结果表明,该重组酶的分子质量为66 ku,与预期大小相符.基于表达载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好,对该酶的大规模发酵应用具有重要意义.     

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD4500.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%~4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

延边黄牛气肿疽间接ELISA诊断方法的建立

[目的]检测延边黄牛气肿疽病原体,为牛气肿疽的检测提供科学方法和依据。[方法]采用气肿疽梭菌裂解菌体为抗原,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法,确定其最适工作条件。[结果]气肿疽梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50μg/m l;待检血清的最适稀释度为1∶200,酶标二抗的最适工作浓度为1∶2 000;对随机采集于延边地区的30份牛血清样品进行间接ELISA检测,阳性率为20%。[结论]建立的间接ELISA方法特异性和重复性好。     

饲料中添加丁酸梭菌对草鱼生长性能、免疫力及抗嗜水气单胞菌的影响

摘 要：旨在研究饲料中添加丁酸梭菌（Clostridium butyricum）对草鱼（Ctenopharyngodon idella）生长性能及血清酶活、免疫功能和抗病能力的影响,选用初始体质量为[ (23.78±0.68) g]的健康草鱼600尾,随机分为4组,每组3个重复,每个重复50尾。对照组（T0组）只投喂基础饲料,实验组（T1、T2、T3组）分别投喂添加1×107、1×108、1×109 cfu/g 丁酸梭菌的饲料,实验周期为56 d。结果表明：与T0组相比,T1、T2和T3组草鱼的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）显著增加,存活率（SR）无显著差异。与T0组相比,T1、T2和T3组草鱼的血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）活性显著增高,补体C3含量显著增高,但谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性显著降低。与T0组相比,T1、T2和T3组草鱼的免疫相关基因白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-1β（IL-1β）、免疫球蛋白M（IgM）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA相对表达量显著上调。投喂益生菌56 d后,用嗜水气单胞菌对草鱼进行攻毒实验,与T0组相比,T1、T2和T3组草鱼的累积死亡率显著降低。综上所述,饲料中添加丁酸梭菌可以提高草鱼的生长性能、血清抗氧化能力、机体免疫力以及抗病能力。