牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪的生长性能、血液生化指标和肠道吸收与屏障功能的影响

【目的】 试验旨在探讨槲皮素在防治仔猪感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）中的作用。【方法】 选取18头体重相近、健康的7日龄仔猪（杜×长×大）,随机分为3组（对照组、PEDV组和PEDV+槲皮素组）,每组6个重复,每个重复1头猪,试验期共11 d。经过3 d适应期后,于试验第4~10天给PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其他组仔猪口腔灌服等体积的人工乳,于试验第8天给PEDV组与PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服1×10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组灌服等体积的PBS溶液。试验第11天早上空腹称重,全部仔猪灌服D-木糖（0.1 g/kg BW）,1 h后经前腔静脉采血,检测血液生化指标、血浆二胺氧化酶（DAO）活性和D-木糖含量;将所有仔猪屠宰取空肠黏膜,检测肠道屏障相关基因,包括肠绒毛蛋白（villin）,紧密连接蛋白-1（claudin-1）,闭合蛋白（occludin）和肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）的相对表达量。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪平均日增重显著下降（P<0.05）,粪便评分显著升高（P<0.05）;血液中高密度脂蛋白含量显著降低（P<0.05）,肌酐和尿素氮的含量显著提高（P<0.05）;血浆中D-木糖含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、iFABP基因的相对表达量显著下调（P<0.05）。与PEDV组相比,PEDV+槲皮素组仔猪平均日增重和血浆D-木糖含量显著升高（P<0.05）;血液中肌酐和尿素氮的含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、villin和iFABP基因的相对表达量显著上调（P<0.05）。【结论】 10 mg/kg BW槲皮素可在一定程度上缓解PEDV感染导致的仔猪生长抑制和肾功能损伤,增强肠道吸收与屏障功能。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪肠道形态、抗氧化功能及空肠脂质代谢基因表达的影响

【目的】 通过研究槲皮素对猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染仔猪肠道形态、肠道抗氧化功能及空肠脂质代谢相关基因相对表达量的影响,旨在探讨槲皮素对PEDV感染仔猪肠道的保护作用。【方法】 选取18头健康的7日龄断奶仔猪,随机分为3组：对照组、PEDV组和槲皮素＋PEDV组,每组6个重复,每个重复1头猪。试验期8 d,于试验第0~7天,对槲皮素＋PEDV组仔猪每天口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其余组灌服等体积的人工奶。于试验第5天晚上给PEDV组和槲皮素＋PEDV组仔猪口腔灌服10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组仔猪灌服相同体积的PBS溶液。于试验第8天早上屠宰,取仔猪十二指肠、空肠、回肠及结肠组织样品进行检测。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著降低（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活力显著降低（P<0.05）,十二指肠、空肠、回肠和结肠中过氧化氢酶（CAT）的活力显著降低（P<0.05）,回肠和结肠中丙二醛（MDA）的含量显著升高（P<0.05）,空肠中载脂蛋白A1（APOA1）、载脂蛋白B （APOB）、载脂蛋白C2（APOC2）、脂肪酸结合蛋白2（FABP2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL-3）和脂肪酸合酶（FASN）基因的相对表达量极显著下调（P<0.01）。与PEDV组相比,槲皮素＋PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著提高（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中GSH-Px和T-SOD的活力显著提高（P<0.05）,十二指肠、空肠和结肠中CAT的活力显著提高（P<0.05）,回肠和结肠中MDA的含量显著降低（P<0.05）,空肠中APOB、FABP2和FASN基因的相对表达量极显著上调（P<0.01）。【结论】 添加槲皮素可有效缓解PEDV感染导致的仔猪肠道损伤,提高仔猪肠道抗氧化能力以及空肠脂质代谢的能力。     

粪肠球菌替代抗生素对断奶仔猪生长性能、腹泻率、血液生化指标和免疫器官的影响

本试验在断奶仔猪饲粮中添加不同水平的粪肠球菌,研究其替代抗生素对断奶仔猪生长性能、腹泻指数和腹泻率、血液生化指标以及免疫器官的影响。选取120头(28±2)日龄平均体重为(7.60±0.81)kg的"杜×长×大"断奶仔猪,随机分为5组,每组6个重复(公母各占1/2),每个重复4头,每个重复为1圈。对照组饲喂基础饲粮,抗生素组在基础饲粮中添加100mg/kg硫酸黏菌素和400 mg/kg杆菌肽锌,3个粪肠球菌组分别在基础饲粮中添加40、200和1 000 mg/kg粪肠球菌,试验期31 d。试验结果显示:1)在1~14 d,饲粮中添加抗生素和粪肠球菌对断奶仔猪的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)以及料重比(F/G)无显著影响(P0.05)。在15~31 d,与对照组和抗生素组相比,200和1 000 mg/kg组可极显著提高ADFI和ADG(P0.01)。在1~31 d,与对照组相比,200和1 000 mg/kg组的ADFI均极显著提高(P0.01),而ADG分别显著和极显著增加(P0.05和P0.01);与抗生素组相比,1 000 mg/kg组可极显著提高ADFI(P0.01),而200和1 000 mg/kg组的ADG分别显著和极显著增加(P0.05和P0.01)。2)在1~14 d,与对照组相比,40 mg/kg组的腹泻指数和腹泻率显著降低(P0.05)。在15~31 d和1~31 d,与对照组和抗生素组相比,40和1 000 mg/kg组均可在一定程度上降低腹泻率(P0.05)。3)与对照组相比,粪肠球菌可以显著提高血液中总蛋白含量(P0.05),其中200和1 000 mg/kg组达到极显著水平(P0.01),且这2组分别可以显著和极显著提高球蛋白含量(P0.05和P0.01)。与抗生素组相比,200和1 000 mg/kg组可以显著提高总蛋白含量(P0.05)。与对照组相比,抗生素组和1 000 mg/kg组的白球比显著降低(P0.05),另外,抗生素组血液中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著降低(P0.05),200 mg/kg组的谷丙转氨酶活性显著降低(P0.05)。4)与对照组相比,1 000 mg/kg组的肝脏重量和脾脏指数有一定程度的提高(P0.05),与抗生素组相比,200和1 000 mg/kg组可显著提高肝脏重量(P0.05)。结果表明,饲粮中添加粪肠球菌可改善断奶仔猪的生长性能(饲喂15~31 d),降低腹泻率,提高仔猪免疫力,其中添加量为1 000 mg/kg时效果最好。     

Genetic characterization of bovine viral diarrhea virus strains in Beijing,China and innate immune responses of peripheral blood mononuclear cells in persistently infected dairy cattle

To acquire epidemiological data on the bovine viral diarrhea virus (BVDV) and identify cattle persistently infected (PI) with this virus, 4,327 samples from Holstein dairy cows were screened over a four-year period in Beijing, China. Eighteen BVD viruses were isolated, 12 from PI cattle. Based on genetic analysis of their 5''-untranslated region (5''-UTR), the 18 isolates were assigned to subgenotype BVDV-1m, 1a, 1d, 1q, and 1b. To investigate the innate immune responses in the peripheral-blood mononuclear cells of PI cattle, the expression of Toll-like receptors (TLRs), RIG-I-like receptors, interferon-α (IFN-α), IFN-β, myxovirus (influenza virus) resistance 1 (MX1), and interferon stimulatory gene 15 (ISG15) was assessed by qPCR. When compared with healthy cattle, the expression of TLR-7, IFN-α, and IFN-β mRNA was downregulated, but the expression of MX1 and ISG-15 mRNA was upregulated in PI cattle. Immunoblotting analysis revealed that the expression of interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and IRF-7 was lower in PI cattle than in healthy cattle. Thus, BVDV-1m and 1a are the predominant subgenotypes in the Beijing region, and the strains are highly divergent. Our findings also suggest that the TLR-7/IRF-7 signaling pathway plays a role in evasion of host restriction by BVDV.     

一起猪流行性腹泻病毒与博卡病毒混合感染病例分析

陕西渭南某猪场发生了一起仔猪腹泻病例,通过临床症状观察、病理解剖、细菌分离以及病原RT-PCR检测,确诊为一起流行性腹泻病毒混感博卡病毒病例。针对发病原因提出了防治措施,为防控仔猪腹泻提供参考。     

仔猪高死亡率腹泻病因探讨

2010年4月以来,全国各地先后出现高死亡率吮乳仔猪腹泻,以冬春寒冷季节多发、持续时间长、高死亡率为特征,日龄越小死亡率越高,用药物及生物制剂均无法有效控制,给养殖业带来巨大的经济损失。按照流行性腹泻病毒感染、霉菌毒素及中毒等采取相应的防治措施,效果均不明显。按中兽医整体观念、辨证论治,将两方面病因有机结合起来,分析该疾病的病理机制,采用中药复方进行临床验证,取得较好的防治效果,为该病的预防和治疗提供了新的思路与方法。