布鲁氏菌分泌蛋白BspI生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析。【结果】BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。PCR成功扩增出675 bp的BspI基因,成功构建了pET-28a-BspI表达载体。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合。间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1∶409 600。【结论】制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性。试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考。     

布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株建立及免疫原性测定

在建立了布氏杆菌单克隆抗体细胞株的基础上,筛选具有强保护作用的单抗细胞株A7免疫BALB/C鼠,并进行细胞融合.用竞争抑制ELISA法筛选出5个强阳性孔,经克隆化培养后首次建立了9个布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株.其中,F9株传25代后及液氮冻存复苏后仍能稳定地产生高效价的抗独特型抗体.其IgG类型鉴定为IgG2a,并证实具有抗原“内影象”.以鼠红细胞为载体将抗独特型抗体吸附其表面进行小鼠免疫试验,检测结果表明该抗独特型抗体具有良好的免疫原性,能诱导免疫小鼠产生相当效价抗布氏杆菌抗体(Ab3).     

重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法及免疫原性研究

[目的]探索重组布鲁菌Omp19蛋白的制备方法,评价其在实验动物中的免疫原性,为中试工艺放大奠定基础。[方法]利用摇瓶培养对重组Omp19蛋白进行原核诱导表达,对培养基类型、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间、诱导时的菌体密度等条件进行筛选;利用阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析对重组Omp19蛋白进行纯化制备;利用SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）对重组Omp19蛋白的纯度进行鉴定;利用动物实验评价制备的重组Omp19蛋白的免疫原性。[结果]摇瓶培养试验表明,重组布鲁菌Omp19蛋白较优的表达条件为：使用LB培养基,在菌密度OD_{600 nm}值为0.6~1.0时加入0.5 mmol/L的IPTG,于28 ℃诱导5 h;经3步纯化后,获得了高纯度的重组Omp19蛋白;免疫原性研究表明,经方法优化后制备的重组Omp19蛋白联合佐剂可以较好地刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体。[结论]优化了重组布鲁菌外膜蛋白Omp19的制备方法,评价了其在小鼠中的免疫原性,为重组布鲁菌疫苗的研发提供了实验基础。