青海省互助县某养殖场部分母羊流产病因的检测

通过虎红平板凝集试验（RBPT）、弓形虫和衣原体间接血凝试验（IHA）,对来自青海省互助县某羊场的19份母羊血清进行了布鲁氏菌、弓形虫和衣原体的血清抗体检测.结果检出衣原体阳性血清1份,阳性率为5.3％;未检出布鲁氏菌和弓形虫的阳性血清.流产胎儿瘤胃液,经PCR检测,为衣原体感染.     

临夏地区布鲁氏菌病防控工作中存在的问题、对策及建议

布鲁氏菌病是一种严重危害畜人类身体健康和畜牧养殖业的急性或慢性人、畜共患传染病,为了确保人、畜的健康和养殖户的经济效益,笔者根据临夏州8县（市）近几年动物感染布病数据,深入分析了临夏地区布病防控现状及存在的问题,探讨布病防控的应对措施,及时、有效阻止疫情的发生、传播和扩散,保障了人、畜安全的同时提高了养殖经济效益。     

布鲁氏菌Omp19基因的生物信息学分析、克隆表达和ELISA方法的初步建立

为了进一步研究布鲁氏菌外膜蛋白19（outer membrane protein 19,OMP19）的结构与功能,并获得具有反应原性的OMP19重组蛋白,建立布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法,试验通过生物信息学软件对OMP19蛋白进行氨基酸序列分析,经PCR技术克隆Omp19基因,利用无缝克隆技术构建重组表达载体pET-32a-Omp19,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导其表达并纯化,并通过Western blotting和ELISA分析方法分别检测OMP19蛋白的反应原性,以建立基于该蛋白的间接ELISA方法。结果显示,OMP19蛋白N端有19个信号肽序列,二级结构以无规则卷曲为主,且OMP19蛋白含有优势抗原表位,利用PCR技术和无缝克隆技术成功构建了Omp19基因的原核表达载体pET-32a-Omp19,成功诱导表达并纯化了OMP19融合蛋白,大小约为35 ku,与理论值相符,并通过Western blotting和ELISA方法鉴定OMP19的反应原性,结果表明该蛋白具有较好的反应原性,且包被浓度为10 μg/mL,一抗稀释比为1：50,二抗稀释比为1：8 000时,P/N值最大,为2.80。本研究结果为布鲁氏菌病快速诊断方法的建立和新型疫苗的研发奠定了理论基础。     

牛种布鲁氏菌ClpS基因突变株的构建及其对毒力的影响

试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株2308和突变株ΔClpS两者之间的差异。结果显示,在相同的培养条件下,亲本株2308和突变株ΔClpS的细菌浓度无明显差异,且两者提取的LPS银染结果基本一致,表明ClpS基因突变不影响布鲁氏菌生长速度,不影响细菌LPS合成;在细胞感染模型中,突变株ΔClpS在感染后72 h的胞内存活能力极显著低于亲本株2308（P<0.01）;小鼠感染试验显示,在感染后1周,亲本株2308感染组和突变株ΔClpS感染组小鼠脾脏重量及细菌含量无显著差异,但在感染后4周,突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏细菌含量为10^3.93 CFU/g脾脏,显著低于亲本株2308（10^6.68 CFU/g脾脏,P<0.01）,且突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏肿胀程度极显著低于亲本株2308（P<0.01）。综上所述,布鲁氏菌ClpS基因突变不影响细菌生长速度及细菌LPS合成能力,但ClpS基因突变可降低布鲁氏菌在小鼠脾脏内的定殖能力。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

基于VNTR技术对布鲁菌的基因多态性研究

应用15个VNTR位点对我国保存的19株布鲁菌标准株和4株减毒活疫苗以及松源地区10株临床分离株进行基因多态性研究。采用15个VNTR位点对33株布鲁菌进行PCR扩增,产物进行琼脂糖电泳,根据产物大小计算序列重复数,据此分析菌株的遗传多态性。建立了15个VNTR位点的琼脂糖凝胶电泳及拷贝数计算分析方法,应用该技术分析了33株布鲁菌的遗传多态性。结果表明这15个位点能较好地区分不同种型或亚型以及减毒活疫苗株,同时也为临床株的分型提供了依据。     

原核表达山羊布氏杆菌M5-90VirB12蛋白及其在检测中的初步应用

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了B.melitensisM5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白.经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25 ku,具有较好的抗原性.以纯化的virB12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份B.melitensis临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,VirB12重组蛋白作为包被抗原可用于B.melitensis感染的血清检测,为进一步建立B.melitensisM5-90 virB12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法.     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应子VceC功能的初步研究

为研究布鲁氏菌(Brucella)Ⅳ型分泌系统效应子VceC的功能,本研究从羊种布鲁氏菌16M株基因组中克隆vceC基因片段,插入pEGFP-N1中,构建真核表达重组pEGFP-vceC。经脂质体转染HPT-8细胞,荧光显微镜观察、western blot鉴定目的蛋白在HPT-8细胞中表达情况,检测细胞凋亡、NO释放量及LDH活力。Western blot检测显示VceC在细胞中表达,转染pEGFP-vceC后的细胞凋亡、细胞上清液中NO释放量及LDH活力比对照组显著增加(p<0.05)。本研究初步表明VceC蛋白具有细胞毒性作用,为进一步研究VceC的功能奠定了基础。     

布鲁菌外膜蛋白的糖基化及免疫效果检测

为研制安全、有效、新型靶向化布鲁菌外膜蛋白疫苗,采用去污剂连续抽提与电洗脱法分离纯化出布鲁菌外膜蛋白,并进行α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯糖基修饰、佐剂乳化.依据统计学中完全随机实验设计试验,免疫BALB/c小鼠,收集不同时间点血液样品,ELISA法检测血清中IgG和IFN-γ含量.结果显示分离纯化出37.5 kD与47.2 kD的目的蛋白并成功糖基化修饰;纳米颗粒佐剂乳化后的试验用疫苗免疫小鼠,血清IFN-γ水平呈显著升高趋势(P＜0.05);抗体水平略显优势,但差异不显著(P＞0.05).表明试验用疫苗能激发机体的细胞免疫应答,且产生了免疫记忆.本研究为研制布鲁菌新型靶向化疫苗的研发和推广提供了研究依据.