Effect of E3 Ubiquitin Ligase Nrdp1 and SOCS-1 on Intracellular Survival and Macrophage Apoptosis Induced by Brucella

In order to investigate the effect of E3 ubiquitin ligase Nrdp1 and SOCS-1 genes on apoptosis during Brucella infection macrophages.The cell models of interference and over expression of Nrdp1 and SOCS-1 genes (pLL3.7-N1,pLL3.7-S1 and pLEX-Nrdp1,pLEX-SOCS-1) were constructed.Normal RAW264.7 cell,pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1 and pLEX-SOCS-1 group cells were infected with Brucella melitensis 16M (referred to 16M),the expression of Bax,Bcl-2,TNF-α genes were detected by qRT-PCR and apoptosis rate was detected by flow cytometry.pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1,pLEX-SOCS-1 cell model of the works best of interference and overexpression Nrdp1,SOCS-1 were successfully constructed and screened.After 16M infecting each group cells,compared with the control group,the expression of Bcl-2 and Bax mRNA in pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1 and pLEX-SOCS-1 groups were significantly different in different time periods (P < 0.05).The expression of TNF-α mRNA in pLL3.7-S1 group was significantly lower (P < 0.05),while the pLEX-SOCS-1 group was significantly higher (P < 0.05).Apoptosis rates in pLEX-Nrdp1,pLEX-SOCS-1 groups were significantly higher (P < 0.05),while pLL3.7-S1 group was lower (P < 0.05).The results showed that the Nrdp1 and SOCS-1 genes were closely related to apoptosis with 16M induction,the research laid the foundation for the study of 16M intracellular parasitism mechanisms.     

布鲁氏菌P39基因的克隆、原核表达及其糖基化修饰

为探究糖基化修饰对布鲁氏菌P39蛋白免疫原性的影响,本试验对布鲁氏菌P39蛋白进行了表达和纯化,并对表达的蛋白进行了甘露六糖修饰。参照GenBank公布的布鲁氏菌P39基因序列设计引物,从布鲁氏菌16M基因组中克隆P39基因片段并连接至pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌株质粒进行酶切等鉴定,鉴定正确后构建重组质粒pGEX-6P-1-P39,对重组蛋白进行诱异表达与条件优化。利用SDS-PAGE和Western blotting对诱导表达的目的蛋白进行分析,将鉴定正确的蛋白经GST亲和层析柱纯化。通过EDC/NHS法对纯化的P39蛋白进行甘露六糖修饰,研究甘露六糖修饰后目的蛋白对巨噬细胞吞噬的影响。结果显示,本试验成功克隆了片段大小为1 206 bp的目的基因,构建了pGEX-6P-1-P39原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达了P39蛋白,该蛋白主要以可溶性形式存在。Western blotting结果显示,在约65 ku处有特异性条带。纯化后获得目的蛋白大小为43 ku,成功对目的蛋白P39进行了糖基化修饰,得到修饰产物与蛋白的摩尔比为2.3∶1。此外,糖基化修饰可显著提前蛋白激活小鼠巨噬细胞的吞噬作用时间。本试验结果可为研究甘露六糖修饰影响P39蛋白免疫原性的机制提供参考。     

布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测与功能富集性分析

为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌（Brucella）感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩（Venn）分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因相对表达量极显著降低（P<0.01）;在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3'非翻译区（3'UTR）结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3'UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。     

布鲁氏菌BPE159基因缺失株的构建及BPE159蛋白对细胞自噬因子表达的影响

【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同...     

Use of Brucella abortus vaccine strain RB51 in pregnant cows after calfhood vaccination with strain 19 in Argentina

One hundred and seven pregnant cows, which had been calfhood vaccinated with Brucella abortus strain 19 (S-19) were revaccinated with either S-19 or strain RB51 (S-RB51). All S-19-revaccinated animals seroconverted, while none of the RB51-revaccinated animals seroconverted. Two out of 25 (8%) S-19-revaccinated animals aborted, while none of the 57 RB51-revaccinated group aborted. Four of the S-19-revaccinated animals shed S-19 in the milk for at least 7 days, while only 1 cow shed S-RB51 for at least 3 days (but <7 days) post-parturition. Revaccination of strain 19 calfhood-vaccinated, pregnant cattle with S-RB51 appears to be a safe procedure with no diagnostically negative consequences.     

布鲁菌分泌蛋白BspG的亚细胞定位分析

本研究旨在确定布鲁菌分泌蛋白BspG在宿主细胞中的亚细胞定位.通过生物信息学分析预测BspG蛋白序列特征及功能域,构建立体模型;使用常规分子克隆技术以布鲁菌16M株为模板进行目的基因扩增,构建pMD19-T-BspG克隆载体及pDsRed2-C1-BspG重组真核表达载体,真核载体转染HEK293T细胞,RT-PCR检...     

布鲁菌免疫分子研究进展

布鲁菌病是布鲁菌引起的人兽共患传染病,包括7种21型,其中感染人的主要有牛、羊、猪布鲁菌3种,其免疫涉及体液免疫和细胞免疫.在布鲁菌的免疫过程中,先天性免疫应答主要通过补体、自然杀伤细胞、巨噬细胞、细胞因子等的参与.获得性免疫应答中,CD4 、CD8 、γβT细胞起重要作用.布鲁菌重组亚单位疫苗是近年研究的热点,而且发现的免疫分子也很多.文章围绕布鲁菌免疫机理、免疫相关分子进行探讨,为筛选疫苗候选分子奠定基础.     

1种布鲁氏菌微滴式数字PCR检测方法的建立

本研究旨在构建1种布鲁氏菌（Brucella）微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法。然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度，并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验。结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol·L^-1和250 nmol·L^-1，最佳的退火温度为58℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.12 copies·μL^-1，与大肠杆菌O：157菌株等其他4种细菌无交叉反应，而且批内重复性和批间重复性都较好。综上表明，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对布鲁氏菌感染的临床样品进行定量检测。     

布鲁菌疫苗株Rev.1全基因序列的测定与分析

为促进布鲁菌病Rev.1疫苗及相关疫苗的研发, 该研究提取Rev.1疫苗株核酸, 应用PacBio平台进行全基因序列测定与分析。结果表明, Rev.1疫苗株基因组大小约3 299 187 bp, G+C含量为57.2%, 组装为染色体1、染色体2两条环状基因组, 大小分别为2 121 370、1 177 817 bp, G+C含量分别为57.2%、57.3%。将其Ery、BLS和VirB10基因序列与9株GenBank上发表的布鲁菌参考菌株的Ery、BLS和VirB10基因序列进行比较分析, 存在不同程度的差异, 同源性为97.4%~100%。     

布鲁氏菌表面抗原研究进展

布鲁氏菌表面最主要的抗原是脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMPs),R-LPS是R型布鲁氏菌主要的表面抗原,S型布鲁氏菌的S-LPS已被证明是一个主要的毒力因子,它的O链部分含有布鲁氏菌表面绝大多数的抗原位点,是一个很重要的保护性抗原;OMPs被认为是布鲁氏菌表面潜在的抗原结构,在光滑型布鲁氏菌表面,由于OMPs受到了LPS-O链的干扰,致使它的抗原性没有充分地表现出来,但在绵羊布鲁氏菌表面却出现了不同的情况。未来几年,对OMPs的研究将成为该领域的热点,尤其是对Omp25突变体的研究。