CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

饲喂不同方法处理的高粱对绵羊瘤胃微生物蛋白生产的影响

25只绵羊分成5组，每组5只，每只羊每天喂给苜蓿二草420g，另加用下列方法处理的高粱子实280g：a.未处理的高粱；b.微波处理（1．5g高梁微波处理15min）；c。120℃蒸汽处理10min；d。0．5％洗涤剂浸泡30min；e．水浸泡30min。用嘌呤衍生物在尿中的排泄量估测瘤胃微生物蛋白的产量。瘤胃微生物蛋白产量及其生产效率均未受高粱处理方法的影响。     

小尾寒羊冷冻精液制作保存技术

在制作小尾寒羊冻精颗粒时，对其冷冻稀释液和甘油浓度进行了研究。结果表明，2＃稀释液效果最好（P＜0．05），甘油浓度为6％时的冷冻效果最佳（P＜0．01）；在40－50℃解冻后，其活力可达0．5以上。     

宁夏农垦万只商品肉羊生产场羊群结构的优化与设计

为了稳步推进宁夏农垦企业集团百万肉羊产业化生产,笔者结合宁夏农垦生产实际,在既充分考虑宁夏农垦百万肉羊良种繁育和杂交利用体系的总体建设方案和现有建设实际,又紧密结合商品肉羊生产场目前技术力量和实际生产水平的前提下,提出了宁夏农垦万只商品肉羊生产场羊群结构优化与设计的具体方案:优秀种公羊50只,占羊只总数的0.5%,其中6月龄、1岁、2岁、3岁、4岁、5岁公羊分别占公羊总数的24%、18%、16%、16%、14%、12%;二元杂交母羊9950只,占羊只总数的99.5%,其中6月龄、1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、6岁母羊分别占母羊总数的18.3%、16.4%、15.6%、14.5%、13.2%、11.8%、10.2%。     

基于优化的长短时记忆神经网络牧群采食量估测模型

为了能够较为精准的估测牧群的采食量信息,提出一种基于遗传算法(genetic algorithm, GA)和长短时记忆神经网络（long short-term memory,LSTM）的牧群采食量估测模型。首先通过皮尔森系数法分析得出影响牧群的采食量的主要影响因子,以减少输入维度并解决信息冗余问题。在此基础上,构建基于 LSTM 神经网络算法的牧群采食量估测模型,并引入遗传算法来优化LSTM 神经网络模型参数来增加模型的可靠性。最后,利用该模型对牧群采食量进行估测。试验结果表明：该采食量估测模型各评价指标平均绝对误差(mean absolute error,MAE)、平均绝对百分比误差(mean absolute percentage error,MAPE)、以及均方根误差（root mean square error,RMSE）分别为2.982、9.85%和6.108。与单一的LSTM神经网络以及GRU神经网络模型相比,均优于其他模型;且该模型具有较好的估测性能和较强的泛化能力,能够为合理轮牧提供科学指导,对草地保护有一定的应用价值。     

杜泊、萨福克、无角陶塞特与小尾寒羊杂交肥羔肉质特性的研究

选在相同条件下饲养的杜泊、萨福克、无角陶塞特与小尾寒羊杂交一代及小尾寒羊(公羔、5～6 月龄、体重46～48.5 kg)共16只,每个处理4只.经屠宰取背最长肌和股二头肌各半制备样品,测定肌肉中化学成分、氨基酸、矿物质和微量元素含量.结果表明:粗蛋白质含量,萨寒F1 20.8%,陶寒F1 20.5%,杜寒F1 20.1%,均高于小尾寒羊(19.6%).每百克肉中17种氨基酸总量也分别高于小尾寒羊,依次为萨寒F1(20.09g),陶寒F1(19.78g);杜寒F1(19.13g);小尾寒羊(18.42g).人体营养所需要的必需氨基酸总量分别比小尾寒羊提高8.86%;8.54%和2.16%,其中组氨酸的含量显著高于小尾寒羊(P＜0.05);杜寒F1和陶寒F1的蛋氨酸含量也显著高于小尾寒羊(P＜0.05).与风味(鲜味)有直接关系的天冬氨酸和谷氨酸含量也分别比小尾寒羊高.萨寒F1和陶寒F1粗脂肪含量高于小尾寒羊(P＜0.05).杂交肥羔钙极显著高于小尾寒羊(P＜0.01),铁、锰、硒含量也显著高于小尾寒羊(P＜0.05);而小尾寒羊肥羔肉含锌量(34mg)高于杂交羊;有毒有害元素均未检出,综合评定杂交肥羔肉的营养价值和肉质品质均优于小尾寒羊.     

羊衣对我国西部羊毛品质和产量的影响

甘肃高山细毛羊常年生活在海拔3000米高的我国西北地区,其自然环境相当恶劣,夏天温度很高,春天风沙很大,紫外线很强烈.羊毛的产量和质量严重受这些因素影响.羊衣可解决这些不良因素的影响,当绵羊穿上这种衣服时,平均试验羊个体净毛量提高0.44Kg,毛束长度提高0.33cm,净毛率提高30.57%.所以绵羊穿上这种衣服可控制风沙、灰尘、紫外线的侵害,达到提高羊毛品质的目的.     

绵羊体外受精的TCM199渐变培养体系的研究

应用TCM199作卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎培养的基础培养液,再添加不同组分组成TCM199体外受精渐变培养体系,进行绵羊体外受精的研究.结果表明:TCM199体外受精渐变培养体系(试验组)与目前沿用的常规体外受精体系(对照组)相比较,虽然成熟率差异不显著(81.3%,80.4%),但能显著提高绵羊卵母细胞体外受精后的卵裂率(72.1%,50.8%)和桑囊率(94.8%,24.5%).这说明TCM199体外受精渐变培养体系能有效地克服早期胚胎发育阻断.     

不同水平大豆寡糖(SBOS)对生长绵羊瘤胃发酵的影响

采用体外批次培养法,研究在日粮中添加不同水平SBOS对绵羊瘤胃发酵功能的影响。SBOS的添加水平分别为基础日粮的0,0.4%,0.8%,1.2%,1.6%和2.0%等6个水平,即1个对照组(0水平组)5个试验组,每个组3个重复。结果表明:体外培养24 h,日粮中添加SBOS可以增加瘤胃液NH3-N、丙酸及总VFA、MCP浓度,提高培养底物NDF降解率,降低瘤胃液pH值、乙/丙比值,对瘤胃产气量、瘤胃液乙酸、丁酸浓度影响不显著。应用综合评定指标(MFAEI)对产气量、pH、MCP浓度、总VFA浓度、NH3-N浓度和NDF含量进行综合评定,得出添加量为1.2%的SBOS更有利于调控瘤胃发酵。     

我国羊隐孢子虫感染情况及危险因素

隐孢子虫是可以感染小反刍动物的肠道原生生物,具有潜在的公共卫生学问题.隐孢子虫可引起人和动物的腹泻和肠道疾病,严重情况下会出现死亡.被感染的动物可能是人畜共患型隐孢子虫的宿主,可引起公共卫生风险、农场利润减少和动物福利等问题.隐孢子虫病已被报道是新生牛、羊等反刍动物腹泻和死亡的一个重要原因,认为是新生羔羊腹泻的第二大诱...