酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。     

VIGS载体在果树中的应用研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御反应,属于转录后基因沉默现象,现在已被开发成通过改造含有目的基因片段的病毒载体来抑制植物内源基因表达的遗传技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS技术具有简便、高效、高通量的优势,近年来在果树基因功能的研究中发挥了重要作用。由于VIGS技术需要借助病毒载体来实现,所以选择适宜的病毒载体是在性状各异的果树中成功构建VIGS体系的关键。本文介绍了在果树中应用的VIGS载体及其在基因功能研究中的应用实例,并分析了病毒载体在诱导果树基因沉默时存在的一些问题及解决方法。     

牛流行热病毒山东分离株α3基因序列分析及原核表达与纯化

为深入研究牛流行热病毒(BEFV)编码的α3非结构蛋白的功能及其在研发新型BEFV疫苗和诊断试剂上的应用,本研究对本实验室分离保存的BEFV采用RT-PCR法对其α3基因进行扩增;用DNAStar软件对序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;用ProtParam和抗原表位分析生物信息学软件研究α3蛋白的亲水性、优势抗原表位区...     

鱼类诺达病毒及其所导致的疾病

In recent years, piscine nodaviruses have emerged as major pathogens of a wide range of larval and juvenile marine finfish resulting in high mortality in aquaculture worldwide. Affected fish exhibit a range of neurological signs, such as erratic swimming behaviour with the associated microscopic lesions of necrosis and vacuolation of the central nervous tissues and retina. Numerous roundshaped, unenveloped and 25-30 nm in diameter virus particles were found in the cytoplasm of affected retinal and nerve cells. Nodaviruses have a bipartite genome of positivesense RNA,with RNA1 encoding the RNAdependent RNA polymerase and RNA2 encoding the capsid protein. Both RNA are capped, but not polyadenylated. The family Nodaviridae comprises two genera: Alphanodavirus and Betanodavirus, members of which primarily infect insects and fish, respectively. Therefore, betanodavirus is also named piscine nodavirus. At present, piscine nodaviruses are divided into four genotypes based on partial sequences of the coat protein gene. ELISA and RT-PCR amplification have been developed as specific diagnostic methods for the d etection of the virus. Antibodies to striped jack (Pseudocaranx dentex) nervous necrosis (SJNNV) were found in 65% of plasma samples collected from wild and domestic brood stocks of striped jack, suggesting that the virus is very prevalent. Viral antigens were detected in eggs, larvae, and ovaries of hatcheryreared and wild spawner fish, suggesting both horizontal and vertical modes of transmission of the virus. Selection of nodavirusfree spawners using ELISA for detection of antigens and RT-PCR techniques have successfully reduced incidences of the virus infections in juvenile sea bass (Dicentrarchus labrax),striped jack and barfin flounder (Verasper moseri). The SSN1 and GF cell lines have been successfully used in isolating piscinenodaviruses.Although there are many papers describing the molecular characteristics of betanodavirus, our knowledge of the genomic attributes of these viruses is still limited. Vaccination studies are being undertaken by a number of researchers and need to be fostered. In particular, the use of passive immunization of broodfish with homologous and heterologous, high titre antisera are worthy of investigation.     

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）为抗原免疫Balb/c小鼠,而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合,以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞,阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分,且多个荧光信号相连呈现链圈状,有限稀释 法克隆阳性杂交瘤细胞,三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株（1A8、1D7、2B6、2D11）。应用Western-blotting法分析单抗识别蛋白的分子量,结果显示,单抗1D7 和2B6均能特异性结合一条分子量116 kD病毒多肽;应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇,结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围,且背景清洁,无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116 kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白,且具有线性抗原决定簇。     

不同番茄材料黄化曲叶病毒病抗性评价及抗性基因检测

以15份自育的无限生长型番茄材料为试材,抗番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)品种‘齐达利’和感病品种‘Money Maker’(MM)为对照,采用苗期农杆菌接种法,研究接种黄化曲叶病毒后的病情指数,幼苗叶片防御酶活性的变化,不同基因型番茄材料的抗性水平。结果表明:853、857、867表现为免疫;817、842表现为高抗;805、818、819、820、841表现为中抗;801、802、803、822为感病。853、857、867的防御酶(PAL、PPO、POD)活性在发病初期均达到峰值,且整体高于其他接种材料,其他接种材料酶活性峰值则出现较晚。含抗性基因的接种材料均表现出不同程度的抗性,含有纯合 Ty-1和 Ty-3基因的853、857、867对TYLCV抗性更高。经综合评价,853、857、867可作为抗番茄黄化曲叶病毒病的优良番茄材料,817、842可作为备选材料。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10³拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

三明地区柑橘黄化脉明病毒检测及分析

为查明三明地区柑橘黄化脉明病毒病发病情况,对主产区疑似感染柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的柑橘新梢叶片样本进行实时荧光定量RT-qPCR检测及分析.结果表明,217份样品中检出CYVCV阳性样本123份,阳性检出率为57％.确定三明地区柑橘树叶脉透明(...     

梨离体植株中苹果茎沟病毒的脱除技术

为建立苹果茎沟病毒(ASGV,Apple stem grooving virus)的有效脱除方法,以3个梨品种的离体植株为材料,比较了4种脱毒方法对ASGV的效果.结果 显示,3个梨品种的离体植株在茎尖培养、茎尖病毒醚处理、茎尖变温热处理和茎尖病毒醚加变温热处理后,其平均脱毒率分别为50.0％、70.8％、69.6％和...     

辣椒抗番茄环纹斑点病毒的种质资源筛选

番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus,TZSV)是严重危害辣椒、番茄和烟草等经济作物的番茄斑萎病毒科病毒,选育抗病品种是防治TZSV的重要途径之一.本试验采用室内摩擦接种、病情指数调查、间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)对40个辣椒栽培品种进行TZSV抗性评价.结果表明,丰达108、海...