基于16S rDNA扩增子测序技术分析四川省奶牛乳房炎乳汁中微生物菌落多样性

为了掌握四川省部分地区奶牛乳房炎致病微生物的主要流行趋势,为针对性地使用抗生素治疗和防控奶牛乳房炎提供科学依据,本研究利用16S rDNA扩增子测序技术对四川成都市、眉山市、凉山州3地区的10家养殖场的奶牛乳房炎乳汁和正常乳汁微生物菌群多样性进行比较分析.结果表明:本地调查的正常奶牛乳汁与患乳房炎奶牛乳汁中无乳链球菌、...     

转基因玉米TC1507质粒DNA标准物质的研制

标准物质具有特定量值、均匀性和稳定性三大典型特征,也是其作为测量标尺的依据.转基因生物标准物质是我国转基因产品标识制度顺利实施的关键技术支撑之一.文章以转基因玉米TC1507为对象,制备了转化体特异性的新型质粒DNA标准物质pTC1507,并对其均匀性、稳定性、量值进行了评价和测定.测试结果表明,制备的质粒DNA标准物...     

猪圆环病毒2型BF株ORF2基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR从构建的猪圆环病毒2型／(PCV2)ORF2重组质粒(pGEM-T-ORF2）中扩增出大小为593bp的ORb2基因，克隆到表达载体pET-32a，经异丙基硫代半乳糖苷诱导，成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量40kD，表达量20％左右。经Western blot检测，重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化质粒pBGll12构建和水稻遗传转化

将一个2．8kb的CaMV35S启动子／SchiA编码区／Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIAl301的多克隆酶切位点,得到1个14．6kb的新植物转化质粒pBGlll2,用花器介导法转化水稻(Oryza sativa),经PCR检测,初步证实已将目的基因整合到受体植物的基冈组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和稻瘟病(Pyricularia oryzae)的抗性较非转化对照增强。RT—PCR表明抗病性植株为阳性,而不抗病的植株为阴性。将RT—PCR产物测序后,用BLAST软件分析序列可知,该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株,表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。     

水稻白叶枯病菌拮抗细菌B56菌株的拮抗活性研究

B56 菌株经30 ℃振荡培养去菌体,其上清液经2 m ol/L 硫酸铵沉淀获得对水稻白叶枯病菌有拮抗活性的初提液。该初提液具有耐热性,经一定强度热处理后仍保持强的抑菌能力;抑菌效果在pH3～9 之间无明显差异;用胰蛋白酶、蛋白酶K 等处理后拮抗活性无明显变化。利用PhenylSepharose CL-4B疏水色谱柱和DEAE-Sephacel阴离子交换柱分离B56 菌株初提液, 得到一个具有拮抗活性的洗脱峰。该洗脱峰经SDS-PAGE检测发现具有一条分子量约为36 kD 的蛋白带。质粒提取和检测发现B56菌株存在一个稳定的内源质粒。     

设计表达兔防御素基因NP1

利用计算机软件对在将大肠杆菌中表达的兔防御素NP-1基因进行分析。消除宿主菌不表达或低效表达的密码子。同时对NP-1基因与质粒pGEX-4T-1中融合基因GST。进行RNA二级结构预测，通过对RNA二级结构进行分析，消除可能影响基因表达的二级结构，设计了有利于今后对目的基因的表达的兔防御素基因，并在大肠杆菌高效表达。结果表明：合成基因可以在大肠杆菌中高效表达。     

cry Ia基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因cryIa的现有载体进行了改造,并引入了筛选标记基因bar,为提高目的基因的表达水平,还在目的基因5′端引入了Ω和Kozak序列,3′端引入了poly(A)序列。成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4ABBar,该载体含有顺向连接的Ubi-cryIa及Ubi-bar基因表达盒,可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化,人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因cryIa可以编码对鳞翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

转基因大豆MON89788检测质粒标准分子构建与应用

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子.[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3'端特异性序列和5'端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证.[结果]获得了3 700 bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1 029 bp.该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10 copy.[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代NON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测. Abstract： [Objective] The aim was to construct a plasmid reference molecule (PRM) for detection of transgenic soybean MON89788.[Method]the lectin gene sequence,3'-junction and 5'-junction sequence between host plant DNA integrated DNA of MON89788 soybean were amplified independently,and the three fragments were cloned into the cloning vector pMD18-T in order through molecular manipulation method to construct pMD-LM3M5,the applicability of the constructed novel PRM was tested. [Result] Sequencing confirmation result showed that the PRM was 3 700 bp in length,containing 1 029 bp of recombined DNA fragment.The limits of qualitative detection of the PRM were 10 copies,[Conclusion]The PRM constructed in this study was suitable for the identification of MON89788 event.     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因表达质粒免疫小鼠的试验研究

基因疫苗是近几年来发展起来的一种新型疫苗，具有使用安全，生产、运输、贮存方便，免疫效果稳定持久的特点。实验采用PCR方法将从洛阳种牛场西门塔尔牛精液中分离的牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhino—traeheitis virus，IBRV)洛精株gD基因进行了扩增，经序列测定确证后构建了gD基因的真核表达质粒。将其单独或连同脂质体肌肉注射于BALB／c小鼠，应用ELISA定期检测血清抗体水平。结果表明，含IBRV gD基因的表达质粒能够引起小鼠的特异性血清抗体反应。     

基于II型毒素–抗毒素系统构建ε–聚赖氨酸合成酶的链霉菌稳定表达载体

鉴于ε–聚赖氨酸収酵过程对抗生素压力条件的依赖,尝试基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统(relBE2sca)构建无选择压力下稳定表达ε–聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌表达系统:将抗毒素基因relB2sca与ε–聚赖氨酸合成酶基因pls克隆至表达载体,幵导入淀粉酶产色链霉菌pls缺失突变株,将毒素基因relE2sca整合至淀粉酶产色链霉菌的染色体(突变株YY3),获得包含ε–聚赖氨酸稳定表达的突变株YY1。经过多次传代,相比对照组,在不含抗生素压力条件下,突变株YY1依然能够稳定地合成ε–聚赖氨酸。毒素蛋白RelE2sca的表达会导致变铅青链霉菌、阿维链霉菌和链霉菌FR–008等常用链霉菌异源表达宿主的死亡,提示基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统(relBE2sca)可作为一种通用的遗传标记。