猪传染性胸膜肺炎的血清学抽样调查

采用正向间接血凝（IHA）试验对来自贵州省7个地区19个县（市）35个点的449份血清（随机采集）进行了血清抗体检查。结果显示,猪传染性胸膜肺炎感染率为10％～90％,平均阳性率为38．5％,最高抗体滴度为1：256（占感染猪的1．2％）,成年猪比仔猪感染率高,散养猪比猪场感染率高,被抽检地区均有猪传染性胸膜肺炎感染。     

应用HEV ORF2蛋白McAb间接免疫荧光法检测HEV的研究

应用抗猪戊型肝炎病毒（HEV）ORF2蛋白单克隆抗体和猪戊型肝炎病毒多克隆抗血清对感染猪戊型肝炎病毒的A549细胞培养物进行了间接免疫荧光检测病原的比较研究。单克隆抗体（McAb）进行的间接免疫荧光染色后,HEV感染细胞培养物中多数细胞在其胞浆和细胞膜上出现黄绿色荧光,未接种病毒的细胞培养物被伊文思蓝染成红色,未见有黄绿色荧光染色的细胞存在;多克隆抗血清对接种病毒的细胞培养物染色后,荧光强度高,呈现亮绿色,但未接种HEV的细胞培养物亦有一定的非特异性荧光反应。结果表明,利用所研制的抗HEVORF2蛋白McAb进行间接免疫荧光法对病原检测具有很高的特异性。     

狂犬病诊断基因芯片的建立和检测应用的初步研究

根据已发表的狂犬病病毒（RV）的序列,设计合成能扩增高度保守核（N）蛋白片断的一对引物。通过生物素标记PCR技术,将核（N）蛋白基因片断作为探针点在硝酸素纤维膜上,制作成疾病诊断基因芯片。取160份可疑动物的血液,提取核酸作模板进行PCR扩增,将其产物与诊断基因芯片进行特异性逆向点杂交检测;并用蔗糖密度梯度离心和凝胶层析纯化狂犬病病毒作抗原,建立检测RV抗体的间接ELISA。把以上两种方法应用于临床,结果基因芯片的检测率比ELISA方法和（RT）PCR要高15％左右,表明建立的狂犬病诊断基因芯片具有更高的灵敏度和特异性。     

抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及在抗原捕捉ELISA中的应用

本研究以原核表达、纯化的扎伊尔株埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）VP40蛋白片段免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得一株分泌抗EBOVVP40蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。以重组杆状病毒表达EBOV VP40蛋白为抗原,经Western blot和间接免疫荧光检测该单克隆抗体显示出良好的特异性免疫反应。采用该株杂交瘤细胞系经腹腔注射接种8日龄BALB／c小鼠,制备腹水,并经纯化和HRP标记,获得HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体。从而,初步建立一种抗原捕捉ELSIA诊断方法,以原核表达EBOV VP40蛋白片段兔抗血清为一抗,应用HRP标记的抗EBOV VP40蛋白单克隆抗体检测杆状病毒表达的重组EBOV VP40蛋白显示出良好的敏感性和特异性。结果表明,初步建立的抗原捕捉ELSIA诊断方法有希望成为一种理想的检测EBOV感染的诊断方法。     

猪瘟病毒石门株E2基因在永生化猪血管内皮细胞的表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因定向插入逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2。将pBABE-puro-E2和辅助质粒pVSV-G经磷酸钙共沉淀法转染293GP包装细胞系,将其包装为完整的逆转录病毒假病毒;用包装好的假病毒在polybrene的介导下转导第30代的永生化猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）,用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并将筛选出的阳性细胞腹腔免疫BALB／c小鼠。RT-PCR检测SUVEC内的E2基因,用间接免疫荧光试验鉴定E2蛋白在SUVEC上的表达,间接ELISA试验检测小鼠血清抗体。结果表明,CSFVE2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达,而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体。     

犬瘟热病毒核蛋白基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

应用RT-PCR技术特异扩增出犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid pro-tein,N)高度保守序列,克隆至质粒pMD18-T中获得重组质粒pMD18-T-N,测序结果证实了重组质粒的可靠性。将目的片段克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经1 mmol/L IPTG诱导,N基因融合蛋白获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析表明,表达产物的相对分子质量与预期的55 000相符。Western-blot检测表明,表达产物与CDV标准阳性血清呈阳性反应。在此基础上,初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法。结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原,从而为进一步开发犬瘟热抗体检测试剂盒以及单克隆抗体、胶体金试纸条奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

对含有已构建的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET-ORF2s的BL21菌进行诱导表达,纯化重组蛋白包涵体,Western-blot检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。用该方法对吉林省多个种猪场收集的179份血清样品进行检测,总阳性率为42.5%。由此说明,本试验建立的PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,适用于大规模猪场血清学检测。     

H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立

以pMD18-HA质粒为模板,PCR扩增HA1基因片段并与pET30a连接后,转化宿主菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达HA1蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting检测。结果表明,表达的重组HA1蛋白具有良好的反应原性,分子量约为45 ku。表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感抗体的间接ELISA方法。该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好,通过检测40份血清,与HI检测结果相比较,其符合率达86.5%。该方法为检测H3亚型猪流感抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段。     

达氟沙星单克隆抗体的制备与鉴定

采用碳二亚胺法将达氟沙星与BSA和OVA偶联制成免疫抗原DFLX-BSA、检测抗原DFLX-OVA。采用FeCl3显色反应、紫外扫描分析法对合成的抗原进行了鉴定。用免疫抗原DFLX-BSA腹腔免疫BALB/c小鼠,有限稀释法筛选获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株1株4F9,单抗亚型鉴定为IgG1,并将此细胞株注射小鼠腹腔获得腹水,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行了纯化。纯化后的抗体效价为2.48×10-6,紫外分析方法计算蛋白含量为1.348 mg/mL。     

猪细小病毒PPV—SD1株VP2全基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立

猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一,初产母猪感染PPV后,可引起流产、不孕、产死胎、木乃伊胎等,而母猪本身并不表现临床症状,其他猪感染后也无明显的临床症状,给养猪业造成巨大的经济损失[1].血清学试验证实,VP2蛋白可以诱导产生血凝抑制及中和抗体.本实验室对猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2基因进行了原核表达,利用纯化的蛋白建立了间接ELISA抗体检测方法,为PPV流行病学调查提供了物质基础.