禽流感病毒HA基因在S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)序列设计了1对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增AIV HA基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ/NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-HA。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-HA。提取S2-HA细胞的基因组DNA,PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,成功构建了重组表达载体pMT-HA,转染细胞经10 mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达HA的果蝇S2细胞株。     

禽流感的流行与防控

一．禽流感的流行情况 H5N1病毒是2005年以来危害我国养禽业三大进化分支病毒,具有明显的优势和流行性。WHO、FAO、OIE联合制定了关于高致病性禽流感H5N1病毒HA基因的命名标准,将其划分为0～9共10个Clade,其中2分支和7分支变异最快,也最为严重。Clade2．3．2病毒在我国南方北方均有广泛流行,     

H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增H1N1亚型猪流感病毒广东分离株A／Swine／GuangDong／711／2001HA基因，对其进行了克隆和测序。结果显示，HA基因全长1771bp．共编码579个氨基酸。A／Swine／Guang Dong／711／2001HA基因编码的氨基酸序列中有8个糖基化位点，5个位于HAl基因的第27、28、40、104和287位点，3个位于HA2基因的21、153和213位点。与H1N1亚型猪流感经典毒株比较后发现，血凝素糖基化位点并不是高度保守的。将A／Swine／Guang Dong／711／2001与自Gen Bank读取的1918年人流感毒株A／South Carolina／1／18、1991年人流感毒株A／MD／12／91和1997年猪流感毒株A／Swine／Wisconsin／238／97等进行核苷酸同源性比较分析，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／SouthCarolina／1／18、A／MD／12／91和A／Swine／Wisconsin／238／97等毒株的核苷酸同源性分别为93．9％、94．7％和93．9％。从系统发生树来看，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／South Carolina／1／18和A／Swine／Wisconsin／238／97的亲缘关系相近。     

江苏省部分规模化鸡场H5亚型禽流感免疫抗体水平的调查

用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验对江苏省13个市随机抽取51个规模化鸡场的1425份鸡血清样品进行了H5亚型禽流感(AI H5)免疫抗体的测定。所检1425份血清样品中,有1423份血清样品检测到AI H5免疫抗体,占所检样品的99·86%;免疫抗体在24以上(达免疫保护)的有1395份,占97·89%,其中免疫抗体滴度在26的有281份,占所检样品的19·72%;所抽检的51个规模场免疫抗体保护率均达80%以上,其中有40个规模场鸡只免疫抗体保护率达100%,占所检规模场数的78·43%。结果表明,该省使用的H5亚型禽流感疫苗对鸡免疫原性较好,免疫抗体较整齐;所抽样的规模化养鸡场AI H5疫苗的总体免疫情况优良。     

表达禽流感病毒H5HA、H7HA基因DNA疫苗的免疫原性研究

为研究双顺反子DNA疫苗对禽流感病毒（AIV）的保护作用，将H5和H7亚型AIV的HA基因克隆到同一表达栽体上，构建了双顺反子HA基因表达质粒pCI—H5HA—H7HA。以此质粒肌注免疫4周龄SPF鸡，首次免疫后3周加强免疫，同时设pCI—H5HA和pCI—H7HA联合免疫组及空白对照组，每周采血用微量血凝抑制法检测HI抗体。加强免疫后3周分别以100LD50的高致病力禽流感病毒（HPAIV）A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）和A／FPv／Rostock／34〈（H7N1）进行致死性攻击。结果显示各免疫组均可刺激鸡体产生H5、H7特异性抗体，pCI—H5HA—H7HA诱导产生的抗体对H5N1和H7N1的攻毒保护分别为50%和10％，而pCI—H5HA和pCI—H7HA联合免疫的攻毒保护均为70％。表明双顺反子质粒可诱导鸡产生较好或一定的保护，但免疫效果不够理想，推测与DNA的摄取及其体内表达有关，可望通过调整DNA疫苗的多种因素提高免疫效果。     

猪流感病毒H3N2亚型济南株HA、NA、NP基因的克隆与序列分析

根据GenBank中流感病毒H3N2亚型HA、NA、NP基因序列,分别设计扩增HA、NA、NP基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增猪流感病毒(SIV)H3N2济南株(SW/SD/JT/07(H3N2))HA、NA、NP基因,分别将RT-PCR产物克隆入pMD18-T栽体,进行测序分析.结果显示,SW/SD/JT/07(H3N2)HA基因长度约为1701 bp,编码566个氨基酸,与参考毒株的同源性为65.2%～81.8%;HA0切割位点序列为PENQTR↓G,属非高致病性毒株;SW/SD/JT/07(H3N2)HA蛋白有7个糖基化位点,由于碱基突变缺少了1个糖基化位点,表明其抗原性及其生物学特性发生变化.SW/SD/JT/07(H3N2)与所有参考毒株HA蛋白上的受体结合位点的氨基酸很保守,即98、134、136、138、226位分别为Tyr、Gly、Ser、Ala、Asn.SW/SD/JT/07(H3N2)NA基因长为1413 bp.编码470个氨基酸,与参考毒株的同源性为65.1%～91.8%,NA基因系统发生分析表明SW/SD/JT/07(H3N2)与禽流感病毒H3N2亚型亲缘关系最近.SW/SD/JT/07NA(H3N2)NA蛋白与参考毒株的颈区63、64、65位置均无氨基酸缺失现象,可推测其对病毒的复制能力不会有很大影响.SW/SD/JT/07(H3N2)NP基因长为1565 bp,编码498个氨基酸.与参考毒株的同源性为79.8%～87.8%,NP基因系统发生树分析结果表明,2002年、2004年暴发的西班牙流感同源性较高,亲缘关系较近,而与中国内地广东株同源性小,亲缘关系较远.     

山羊生精上皮细胞分离研究

采用四种酶法分离二月龄关中奶山羊生精上皮细胞,A组:胶原酶Ⅳ;B组:胶原酶Ⅳ +透明质酸酶;C组:胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶与EDTA;D组:胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶与EDTA+DnaseI。结果二月龄羔羊曲细精管主要包含Sertoli细胞、精原细胞和管周排列的肌样细胞。每 200mg睾丸实质收获生精上皮细胞总数 (×105 )A,B,C,D组分别为 6. 91±0. 68, 6. 67±0. 80, 5. 94±0. 81, 5. 74±0. 82;细胞存活率 (% )分别为 76. 82±3. 80, 75. 96±1. 61, 94. 19±2. 89, 92. 32±1. 97;圆形细胞比率 (% )分别为 17. 54±1. 68, 16. 70±1. 46, 23. 64±1. 72, 22. 90±2. 38;细胞贴壁率(% )分别为 5. 93±0. 36, 5. 81±0. 54, 26. 94±1. 54, 25. 00±1. 74。C,D组不但组织块解离效果及细胞离散程度均较A,B好,且原代培养细胞团块数少。多重比较C,D组显著优于A,B组 (P<0.05);C组与D组差异不显著(P>0.05),但与A,B组比较细胞存活率、圆形细胞比率及贴壁率差异极显著(P<0.01)。结论认为C组是较简单有效的山羊生精上皮细胞分离酶组合。     

绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

H9亚型禽流感病毒钦州株HA基因的克隆与遗传进化

采集钦州活禽交易市场的鸡气管和泄殖腔的棉拭予样品,用H9亚型分型引物进行PCR初步筛选,阳性样品经SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,通过RT-PCR方法扩增HA基因,并将其克隆到pMD—18T载体后进行序列测定和分析。结果表明,获得1株H9亚型禽流感病毒命名为：A／Chicken／Guangxi／qz40／2009（简称qz40）。测序结果表明qz40的HA基因片段全长1683bp,编码560个氨基酸;序列同源性比较结果表明,该毒株与参考毒株的核苷酸序列同源性为82．8％．99．9％,推导氨基酸同源性为87．5％．99．6％;HA基因的裂解位点氨基酸顺序为RSSRIGLF,为低致病性毒株;含有7个潜在的N-糖基化位点,其中5个位于HAl部分、2个位于HA2部分;基于H9亚型HA基因的进化树分析表明,qz40株属于欧亚种系的A／Chicken／Beijing／1／94（Ck／Bei—like）群系。     

禽流感病毒HA基因的分子克隆和测序

血凝素（HA）是禽流感病毒诱导机体产生保护性体液免疫反应的主要靶抗原。本研究的目的是克隆HA基因，为以后的表达及基因工程疫苗的研制奠定基础。收获接毒鸡胚的尿囊液，超速离心沉淀病毒，采用异硫氰酸胍法提取病毒RNA，利用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术扩增出禽流感病毒（H9N2亚型）血凝素的cDNA。PCR产物加A尾后，用玻璃奶试剂盒回收纯化目的片段，通过T－A连接将加尾PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-T easy vector，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定，对目的片段进行测序，结果获得了HA基因全长，约1．7kb，与已知序列进行同源性比较，同源性最高的可达97％，所克隆的基因为禽流感HA基因工程疫苗的研究奠定了基础。