日本百脉根LjbHLH34基因克隆及耐旱功能鉴定

干旱是影响植物生长发育的重要环境因素。本研究分析了日本百脉根抗旱相关基因LjbHLH34的耐旱功能，初步解析其响应干旱胁迫的分子机制，以期为百脉根抗旱分子育种提供理论基础。本研究克隆得到的LjbHLH34基因大小为711 bp、编码236个氨基酸，属bHLH转录因子家族成员。系统进化树分析显示，LjbHLH34蛋白与拟南芥bHLHⅣ亚家族中AtbHLH34和AtbHLH104亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明LjbHLH34在日本百脉根的根中表达量最高，叶中次之，茎中最少，暗示其在日本百脉根多个组织中发挥作用；同时LjbHLH34基因也受聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)诱导表达。在酵母中检测发现LjbHLH34具有转录激活活性；亚细胞定位试验表明LjbHLH34蛋白定位于细胞核中。将LjbHLH34基因转入拟南芥获得过表达株系。在200 mmol·L^-1甘露醇胁迫下，LjbHLH34转基因拟南芥的根长明显长于野生型。干旱处理后，野生型拟南芥比转基因拟南芥萎蔫程度更加明显，而转基因株系的相对含水量和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于野生型，丙二醛(MDA)积累...     

葡萄糖和含腺苷分子通过碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)诱导猪脂肪细胞硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)的表达

硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)是一种氧化还原调节蛋白,通过与硫氧还蛋白结合抑制其活性,调节细胞的氧化还原状态,在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用。本研究利用从3~7日龄仔猪(Sus scrofa)皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,应用RNAi沉默碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达,以含0或0.1 mmol/L NAD+的葡萄糖浓度分别为0、5和15 mmol/L的培养液培养,采用实时荧光定量PCR检测Txnip及ChREBP mRNA表达,以探讨葡萄糖和含腺苷分子对猪脂肪细胞Txnip表达的影响及其转录调控途径。结果表明,葡萄糖以浓度依赖方式促进猪脂肪细胞Txnip和ChREBP mRNA表达,无糖条件下NAD+对Txnip mRNA表达没有明显影响,但葡萄糖存在时显著促进其表达。siRNA沉默脂肪细胞ChREBP表达后,葡萄糖对Txnip mRNA表达的促进作用比相同条件下培养的对照细胞有较大幅度降低;以NAD+处理后,Txnip表达在葡萄糖浓度为5和15 mmol/L时分别较对照细胞降低了91%和93%。由此说明,NAD+诱导猪脂肪细胞Txnip转录表达依赖于葡萄糖的参与,ChREBP介导葡萄糖和NAD+对Txnip mRNA表达的诱导作用。研究结果为进一步探讨ChREBP在葡萄糖和脂质稳态中的作用提供了基础。     

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)在细胞及整个生物水平的多方面作用

代谢综合征是多种代谢性疾病的总称,包括肥胖、血脂异常、葡糖耐受不良、炎症和高血压.近年许多研究表明,PPAR可以改善这类代谢异常情况.PPARs是细胞核激素受体超家族配体激活转录因子,分为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三个亚型,分布在各不同组织,功能涵盖广泛.     

基于RNA-seq技术筛选低钙培养奶牛乳腺上皮细胞差异表达基因

本研究拟利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选低钙培养奶牛乳腺上皮细胞(CMEC)差异表达基因,为临床寻找更为准确、灵敏的奶牛低钙血症生物标志物提供方法与思路。利用RNA-seq技术对低钙组CMEC转录组测序,筛选8个差异表达基因进行定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)验证测序结果准确性,对测序数据进行基因功能注释及通路富集分析。结果显示,2组分别得到63 910 842条和66 979 098条滤过读段,共计筛选116个差异表达显著性基因,其中上调基因52个,下调基因64个,并找到调节甲状腺素信号通路的KAT2A基因和参与甲状腺素合成的DUOXA2基因。利用qRT-PCR对测序结果中筛选的8个差异表达基因进行验证,其结果与RNA-seq结果大体一致。结果表明低钙环境影响CMEC基因表达,KAT2A和DUOXA2基因可能参与细胞钙调节。     

AANAT基因在滩羊不同繁殖时期卵巢中的转录差异及DNA甲基化程度分析

试验旨在检测5-羟色胺-N-乙酰基转移酶（AANAT）基因在绵羊休情季节和繁殖季节（卵泡期和黄体期）卵巢组织中的转录差异,并分析转录差异是否由DNA甲基化修饰程度改变所导致。试验采用自然环境条件和饲养管理一致,且体重差异在0.5 kg范围内的空怀母滩羊作为试验动物,采集其休情期、卵泡期和黄体期（每个时期3只）的卵巢组织,采用SYBR染料法进行实时荧光定量PCR检测AANAT基因在滩羊不同繁殖时期卵巢组织中的转录水平。随后针对转录水平有差异的两个时期（休情期和卵泡期）的样本,利用MethPrimer 2.0在线软件预测AANAT基因启动子区和第一外显子区的CpG岛;用重亚硫酸盐测序法（BSP法）检测AANAT基因启动子区及第一外显子区的甲基化程度。试验结果显示,滩羊休情期卵巢组织中AANAT基因转录水平显著低于卵泡期的AANAT基因转录水平（P<0.05）,休情期与黄体期滩羊卵巢组织中AANAT基因的转录水平差异不显著（P>0.05）。滩羊卵巢组织中AANAT基因启动子区上存在着一个长度为173 bp的CpG岛,第一外显子区存在着一个长度为118 bp的CG岛。然而,两个甲基化岛区内的单个CpG位点甲基化程度在滩羊休情期和卵泡期之间均不存在显著差异,暗示AANAT基因的表达受甲基化修饰外的因素调控。本研究结果可为进一步探讨AANAT基因在季节性发情和卵泡成熟中的功能提供参考资料。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌感染小鼠脾脏转录组分析

试验旨在探索羊源D型多杀性巴氏杆菌入侵宿主脾脏组织中引发的免疫应答途径。首先利用羊源D型多杀性巴氏杆菌(HN01菌株)感染小鼠,建立羊源D型多杀性巴氏杆菌感染的动物模型;之后利用转录组测序技术获得感染小鼠与正常小鼠的脾脏转录组数据,并使用COG、KOG、eggNOG、GO、KEGG数据库对测序结果中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行功能注释与分析,同时对于显著富集到关键免疫通路的差异表达基因使用STRING软件和KEGG mapper进行蛋白互作分析,筛选出核心通路中起关键作用的基因;最后选取关键的10个基因进行实时荧光定量RT-PCR验证。转录组分析结果显示,与正常组相比,感染组中筛选出3 380个差异表达基因(P<0.01,log₂|FoldChange|≥0.5),其中1 691个基因上调,1 689个下调。基因功能富集分析结果表明,感染组脾脏中的差异表达基因主要发挥信号转导的功能,其主要参与的生物途径包括细胞因子与细胞因子受体互作通路、趋化因子信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路。蛋白互作分析筛选出约28个核心差异表达基因,结合实时荧光定量RT-PCR验证后,其中9个基因的表达结果与测序一致,分别是C3、Cd4、Cxcl13、Lck、Gnai1、Grap2、IL-6、Cxcr6及Serping1基因。本研究初步证明了脾脏在抵抗多杀性巴氏杆菌入侵中参与了一系列免疫应答反应,为进一步研究羊源D型多杀性巴氏杆菌与宿主之间相互作用的分子机制奠定理论基础。     

MSTN基因编辑牛肌肉转录组测序及生物信息学分析

为探究肌生长抑制素（myostatin,MSTN）基因对牛肌肉发育的具体调控机制,本研究选取同一牛场健康鲁西黄牛10头,其中通过转基因技术得到的基因编辑牛MSTN^-/-和同种非转基因野生型牛各5头。分别采集两组牛腿臀肌肉样品,利用IIlumina HiSeq高通量测序技术进行转录组测序分析,通过生物信息学方法比较两组样本间的差异表达基因,并进行GO和KEGG富集分析,最后利用实时荧光定量PCR验证转录组测序数据。结果显示,基因编辑型牛和野生型牛之间共检测到18 071个基因。在log₂|FoldChange|≥ 1.48条件下,筛选出406个差异表达基因,其中347个显著上调,59个显著下调。GO功能富集分析显示,MSTN基因编辑后显著影响915个功能类别（P<0.05）,差异基因主要参与结合、生物系统调节、免疫系统等相关功能。KEGG通路富集分析结果共涉及211个通路,差异基因主要富集在细胞黏附分子、趋化因子信号通路、细胞因子互作等信号通路上,进一步从中筛选出可能参与细胞生长、肌肉发育的差异基因（CD14、KIT、CSF1R、FBP1、DUSP4、ULBP21、PRKCB、SPN、CHAD、SRC）。实时荧光定量PCR检测结果显示,所选差异基因表达水平与转录组表达水平一致,证明测序结果的可靠性。本研究结果表明,MSTN基因发挥作用后可以介导多个下游基因表达,从而影响相关信号通路及生物学过程;同时,所筛选出的差异表达基因可作为进一步研究骨骼肌调控机制的候选靶标。     

Prokaryotic Expression and Antigenicity Analysis of Porcine Japenese Encephalitis Virus Envelope Protein Domain Ⅲ

In order to analyze the antigenicity of porcine Japanese encephalitis virus (JEV) E protein domain Ⅲ, which was expressed by pET-28a vector with His-tag and purified through Ni-NTA, the BALB/c mice were immunized with the purified protein.We identified the antigenicity of domain Ⅲ of E protein and the anti-mice and anti-porcine JEV E Ⅲ protein specific antibody titers by SDS-PAGE, Western blotting, indirect ELISA and IFA.SDS-PAGE results showed the expressed target protein existed mainly in the form of inclusion body.Western blotting, ELISA test results showed that the protein had good reactivity with anti-serum.The mice immunized with the purified JEV E Ⅲ protein generated 1×10⁵ anti-JEV E Ⅲ protein specific antibody titers by ELISA, and the porcine immunized with the porcine JEV generated 5.1×10⁴ anti-JEV specific antibody titers.The IFA results showed that JEV E Ⅲ protein anti-serum could identify JEV antigen.The above results showed that the recombinant JEV E Ⅲ had good antigenicity.These results provided important basis for development of diagnostic antigen for JEV.     

杜仲转录组基因密码子使用偏好性分析

以杜仲转录组数据为试材,采用CodonW和SPSS软件相结合的方法,研究了杜仲基因密码子组成和长度对基因表达量的影响,以期为将来改造外源基因及利用基因工程技术改良杜仲提供理论基础。结果表明:杜仲转录组中基因的表达量与G3s、C3s、G+C和GC3s含量均呈极显著正相关(P0.01),与A3s含量、T3s含量、单条基因总密码子数(L_aa)和有效密码子数ENC均呈极显著负相关(P0.01),与Aro含量呈显著负相关(P0.05),表明高表达基因的密码子使用偏好性较强,且偏好于使用以G/C结尾的密码子;ENC与C3s、G3s、G+C和GC3含量均呈极显著负相关(P0.01),与A3s、T3s、Aro含量呈极显著正相关(P0.01);确定了15个杜仲最优密码子,分别为AAC、AAG、ACC、AGG、AUC、CAC、CAG、CCG、CUC、CUG、GCC、GGC、GUC、UAC和UCC。果实和叶片特异表达基因在氨基酸Leu、Ile、Ser、Pro、Thr、Asn、Glu和Cys密码子的使用上存在差异。     

葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。