落葵种子蛋白提取工艺优化及其抑菌和抗氧化特性分析

[目的]优化落葵(Basella alba L.)种子蛋白提取工艺,并分析其抑菌和抗氧化特性,为开发利用落葵种子蛋白提供参考依据.[方法]采用盐析法提取落葵种子蛋白,以大肠杆菌为指示菌,通过比较不同浸泡缓冲液、浸泡时间、料液比和硫酸铵饱和度提取蛋白的抑菌效果,选出影响较大的因素进行正交试验从而确定最佳提取方案;通过牛津杯抑菌试验评价落葵种子蛋白对33株菌的抑菌效果,同时对其还原力及清除DPPH自由基能力进行测定.[结果]3个因素对落葵种子蛋白提取效果的影响排序为料液比>硫酸铵饱和度>浸泡时间;其最佳提取工艺为:浸泡时间14 h、料液比1:8、硫酸铵饱和度95%,在此条件下提取物的蛋白含量可达33.00 mg/mL,大肠杆菌抑菌圈直径为19.68 mm.落葵种子蛋白抑菌范围较广,对红酵母、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、藤黄球菌、副溶血性弧菌、假单胞菌、气单胞菌、大肠杆菌等33株菌均具有良好的抑菌效果.落葵种子蛋白还原力测定的半最大效应浓度(EC50)为4.867 mg/mL,对DPPH自由基清除率的半抑制浓度(IC50)为27.817 mg/mL.[结论]落葵种子蛋白具有良好的抑菌效果和抗氧化特性,有作为天然抑菌剂和抗氧化剂的潜在价值.     

滇陆猪Nramp1基因多态性对其在组织中表达的影响

[目的]明确自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响,从分子遗传学角度阐述滇陆猪不同基因型个体对疫病免疫的遗传差异,为其抗病育种选育提供参考依据.[方法]采用PCR对27头滇陆猪Nramp1基因进行扩增,以DNASTAR 5.0进行序列比对分析及多态性(SNP)位点检测;同时利用实时荧光定量PCR检测Nramp1基因在滇陆猪各组织中的相对表达量,并运用SPSS 19.0分析Nramp1基因多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响.[结果]在滇陆猪Nramp1基因第5外显子、第5内含子和第6外显子上分别发现SNP1(T→C)、SNP2(A→G)和SNP3(G→A)等3个SNPs位点,都只存在2种基因型,且SNP1位点和SNP3位点在试验猪群体中属于低度多态[多态信息含量(PIC)/杂合度(He)<0.25)],SNP2位点属于中度多态(0.25肝脏>脾脏>心脏;此外,Nramp1基因在不同基因型滇陆猪群体中表现出的组织差异表达也不同,尤其是Nramp1基因在SNP2位点纯合群体肝脏中的相对表达量显著低于在杂合群体肝脏中的相对表达量,说明Nramp1基因多态性变异对其在滇陆猪组织中的表达有显著影响.[结论]Nramp1基因SNP位点变异能影响Nramp1基因在滇陆猪各组织中的表达变化,从而影响机体的免疫应答反应,其中SNP2位点可作为滇陆猪抗病育种的分子标记.     

不同教槽料对断奶仔猪肠道黏膜免疫相关基因表达的影响

为探讨不同教槽料对断奶仔猪肠道黏膜免疫相关基因表达的影响,选取90头21日龄体质量[(6.85±0.25)kg)]相近的杜洛克×长白×大约克断奶仔猪,随机分为3组。对照组(CON)饲喂基础饲粮,优质蛋白源组(HP)在基础饲粮中添加优质蛋白原料(基础饲粮中的豆粕蛋白原料用发酵酶解豆粕、酵母提取物和小麦水解蛋白粉代替),优质蛋白源+肠道保护包组(HPP)在基础原料中添加优质蛋白原料和肠道保护包(主要成分为复合酸化剂、植物精油、复合益生菌组合)。试验期14 d。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测仔猪饲喂不同教槽料后,十二指肠、空肠、回肠、结肠黏膜TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10的基因表达量,回肠和结肠黏膜紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达情况。结果显示,与CON组相比,仔猪断奶3 d时,HPP组十二指肠IL-1β及回肠IL-1β、Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量均显著升高(P0.05);仔猪断奶7 d时,HP组和HPP组空肠、回肠TNF-α、IL-10的基因表达量升高(P0.05),并且回肠Occludin、Claudin-1、ZO-1的基因表达量显著升高(P0.05);仔猪断奶14 d时,HPP组空肠TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10和回肠TGF-β的基因表达量显著升高(P0.05)。可见,断奶仔猪饲喂新型教槽料能够上调肠道黏膜免疫因子相关基因的表达量,增强早期断奶仔猪回肠和结肠黏膜中紧密连接蛋白相关基因的表达量,降低断奶应激对仔猪肠道造成的损害。     

根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解代谢中agnH基因的克隆表达与纯化

对从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离筛选得到的尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnH基因进行克隆表达,并对AgnH蛋白的表达和纯化条件进行优化,为解析agnH基因的功能和揭示根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解的分子机制提供理论依据。通过PCR扩增获得agnH全长基因(585bp),构建重组质粒pET28a(+)-agnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,研究不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对重组质粒pET28a(+)-agnH诱导表达的影响,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。结果表明:在IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导温度为25℃且诱导时间为25h条件下,AgnH蛋白表达量较高;在250mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的AgnH蛋白。     

猪乙型脑炎病毒E-Ⅲ抗原域蛋白间接ELISA的建立及应用

该研究利用纯化后的流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)E-Ⅲ抗原域蛋白,将其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.试验的最佳反应条件为:最佳抗原包被浓度为17.5 μg/mL,血清抗体稀释度为1∶4,酶标二抗稀释度为1∶5 000,封闭液和稀释液用含0.4％ BSA的PBST.采用该方法对127份临床样品进行检测,结果显示,与商品试剂盒检测结果比较符合率达到90.00％.因此,该研究建立的流行性乙型脑炎间接ELISA检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性.     

电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化

以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响.结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著.不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率.质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8％.     

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取及分子量研究

以藻蓝蛋白(CPC)的提取率为指标,用冻融法对藻蓝蛋白进行提取,最后用SDS-PAGE和排阻色谱法对藻蓝蛋白的分子量分别进行了测定,结果表明,冻融法提取藻蓝蛋白的最优工艺参数为:料液比为1∶22,提取温度35℃,提取时间2.5h,藻蓝蛋白的提取率为3.19%。SDS-PAGE法测得藻蓝蛋白的分子量为40000 Da,排阻色谱法测得藻蓝蛋白的分子量为43200 Da,这2种方法所得的CPC蛋白分子量基本一致。     

家蝇蛋白酶解物体内抗氧化性评价

研究家蝇蛋白酶解物的体内抗氧化作用,可为家蝇幼虫资源的开发利用提供基础。试验将昆明种小鼠随机分为空白对照组(生理盐水)及家蝇蛋白酶解物低剂量组(200μg/g)、中剂量组(400μg/g)、高剂量组(800μg/g),每组10只,检测各组小鼠血清及肝、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及过氧化氢酶(CAT)的活性。结果显示,家蝇蛋白酶解物可以增强小鼠血清、肝、脑组织中SOD,GSH-PX,CAT的活性,且明显高于空白对照组。说明家蝇蛋白酶解物具有显著的体内抗氧化活性。