兔源强毒力金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH₂O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。     

塔城地区某奶牛场牛支原体的分离鉴定及药敏试验

为确定新疆塔城地区某奶牛场部分断奶犊牛出现咳嗽、流脓性鼻涕、腹泻等症状的发病病因,本试验通过对采集到的发病犊牛鼻拭子样品进行分离培养、形态学观察、生化试验、16S rRNA基因和oppD/F基因PCR扩增与测序、药敏试验等。分离培养显示3株分离株在改良Thiaucourt’s琼脂培养基平板上生长出典型的“煎蛋样”菌落,狄氏染色菌落中心呈深蓝色。生化试验中分离株不发酵葡萄糖与甘露醇,不水解精氨酸,不分解尿素,明胶液化试验为阴性。PCR扩增分离株16S rRNA基因测序结果显示,分离株与GenBank数据库中牛支原体16S rRNA基因序列的相似性在98.73%以上;牛支原体特异性基因oppD/F阳性且相似性达99.74%以上。通过药敏试验从9种药物里选择出替加环素、红霉素2种最为敏感的药物。研究结果表明,造成此次犊牛肺炎的病原菌为牛支原体,为临床防治牛支原体病提供了参考。     

植物基因启动子的克隆方法及其应用

植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点,启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR的克隆启动子技术,如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、交错热不对称PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法,分析了它们的优缺点,并展望了今后的研究前景。     

黄瓜DNA提取及优化SSR反应体系的建立

本文简化了黄瓜DNA提取程序并探讨了黄瓜SSR反应程序及体系.反应体系25 μL:10×buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L MgCl2 2.0 μL,2 mmol/L dNTP 2.5 μL,gDNA模板(10 ng/μL)2 μL,forward primer(10 pmol/μL)0.5 μL,reverse primer(10 pmol/μL)0.5 μL,ddH2O 14 μL,Taq DNA聚合酶(1 U/μL)1 μL.反应程序:95℃预变性5 min,94℃变性30 sec,49℃退火1 min,72℃延伸90 sec,循环次数35,72℃延伸5 min.     

贵州省薯类脱毒种苗快繁中心简介

贵州省薯类脱毒种苗快繁中心是农业部发展脱毒马铃薯生产区域布局的重点基本建设项目，共计完成投资800余万元，并于2007年9月通过验收。中心拥有12480m^2温室大棚，其中智能温室960m^2，连栋大棚11520m^2，500m^2常温库和377．3m^3冷库，2000m^2试验大楼，500m^2组培室，以及完备的组培设备。此外中心还拥有酶联及PCR检测的病毒检测分子实验室。中心具有年产马铃薯试管苗350万株，马铃薯原原种1000万粒的能力。[第一段]     

酒红球盖菇菌丝生长对不同培养基的响应

以酒红球盖菇R-4菌株为试材,采用微生物平板培养法,研究了12种氮源和8种碳源对酒红球盖菇生长的影响,以期为酒红球盖菇培养提供参考依据.结果 表明:酒红球盖菇菌丝生长对氮源和碳源的选择差异不显著(P＞0.05),均能利用试验所选的12种氮源和8种碳源,当酵母膏作为氮源和葡萄糖作为碳源时酒红球盖菇的菌落长势较优,菌丝生长速度较快.葡萄糖当作最优碳源时酒红球盖菇菌落生长速率、菌落直径、生长速度、菌丝生长指数分别是9.75 mm· d-1、50.22mm、1.41 mm· d-1和46.73,酵母膏当作最优氮源时酒红球盖菇菌落生长速率、菌落直径、生长速度、菌丝生长指数分别是14.12mm·d-1、52.54mm、2.10 mm·d-1和43.56,由此得出,酒红球盖菇生长的最优碳源是葡萄糖,最优氮源是酵母膏.     

以冻融法快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli DH5α菌株，IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶，利用该酶的热稳定性，反复2次－70℃，75℃交替冻融以裂解细胞释放胞浆；以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化Taq DNA聚合酶的目的。PCR扩增反应和SDS－PAGE分析表明所制备的Tap DNA聚合酶的纯度，活力，敏感性，特异性均达到试验要求。该方法具有快速简便的优点。     

萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因PCR定点突变及其在大肠杆菌中的表达

根据已报道的萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因序列，结合基因及其表达调控中遗传密码的偏爱性，人工合成引物，利用PCR重叠延伸法，使编码序列区的部分核苷酸突变，采用嵌套PCR，迅速克隆到目的基因片段R -AFP,连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌XL1菌株，筛选到阳性克隆。序列分析结果表明，PCR产物全长240bp，有一个阅读框，编码29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白，与突变前的Rs-AFP2基因相比，在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基（TTG→TTA)，第5号氨基酸Gln相差一个碱基（CAG→CAA），第6号稀有密切Arg相差两个碱基（CAG→CGA），但二者编码产生相同。重新合成引物，将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因分别克隆到pET-21b( )质粒载体上，导入大肠杆菌BL21菌株。Tricine-SDS-PAGE电泳显示工程菌中存在6KD左右的目的蛋白带；软件分析显示，突变后pETAFPm的表达产物约为突变前pETAFPo表达产物的2倍；抑菌结果表明，pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比，已有效的提高表达量。     

猪生长激素基因座位BspI、HhaI酶切片段多态特征的研究

生长激素(growth hormone,GH)在多种生理功能中起着重要的作用,对调节动物的新陈代谢、加快生长速度、提高饲料报酬以及改善胴体组成等方面均有显著的作用.     

茶树咖啡因合成酶基因RNA干涉表达载体构建

咖啡因合成酶（TCS）是茶树咖啡因生物合成途径中的一个关键酶,催化7-甲基黄嘌呤转变为可可碱和可可碱转变为咖啡因。抑制TCS基因表达是培育低咖啡因茶树的最有效途径。用RT-PCR方法扩增茶树TCS基因的两个cDNA片段,并克隆入T-载体中。干涉载体和TCS基因片段的T克隆经限制性内切酶两次双酶切与连接,将两个TCS基因片段分别反向重复插入到干涉载体pFGC5941,构建了TCS基因的RNA干涉载体,分别命名为pFGC5941-TCS02和pFGC5941-TCS03。经PCR和DNA测序获得验证。TCS基因RNA干涉载体的构建为培育低咖啡因茶树奠定了基础。