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《中国兽医学报》2019,(12):2298-2304
为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1~10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。 相似文献
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[目的]探究适合观察枣花授粉荧光显微观察效果的最佳制片方法,为枣树授粉受精研究提供方法依据.[方法]以4年生、生长发育良好的'中秋酥脆枣'枣花作为试验材料,经过固定、水洗等步骤,采用不同软化和染色方法对枣花进行处理,压片后在荧光显微镜下拍照,比较不同处理下枣花授粉的荧光显微观察效果.采用NaOH溶液对枣花柱进行软化,设... 相似文献
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采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。 相似文献
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The experiment was conducted to discuss the difference of binding time of green fluorescent protein B.melitensis M5 (GFP-M5) and B.abortus S19 (GFP-S19) infecting the mouse macrophagocyte (RAW264.7),lysosome,endoplasmic reticulum and golgi body in the initial stage and compare the binding rate of GFP-M5,GFP-S19 with organelle in different timeline,respectively,by confocal laser scanning microscope (CLSM) and flow cytometry.The result showed that GFP-M5 and GFP-S19 were successfully constructed.The intracellular survival ability of Brucella M5,Brucella S19,GFP-M5 and GFP-S19 were not obvisouly affected after infecting RAW264.7.GFP-M5 and GFP-S19 could enter the macrophagocyte in 30 mins,and in 2 h the Brucella could reach lysosome,endoplasmic reticulum and golgi body.In addition,the binding time for two attenuated vaccine did not show differences in 1,2,3 and 4 h.The content of GFP+ cell produced by RAW264.7 infected by GFP-M5 and GFP-S19 did not show significant differences (P>0.05).Therefore,the two strains did not have significant differences in the invasion ability in the initial stage of infecting host cell. 相似文献
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To establish a rapid,sensitive and specific assay for the differential detection of Nipah virus (NiV) and highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV),a duplex Real-time RT-PCR was developed with specific primers and probes targeting to the special sequences of NiV M gene and HP-PRRSV nsp2 gene by optimization of reaction conditions.The performance of the assay was linear ranging from 4.6×101 to 4.6×107 copies/μL for RNA standard control of NiV M (NiV-M-RNA) and from 4.1×101 to 4.1×108 copies/μL for RNA standard control of HP-PRRSV nsp2 (HP-PRRSV-nsp2-RNA),and detection limits of the assay was 46 copies for the NiV-M-RNA and 4.1 copies for the HP-PRRSV-nsp2-RNA,respectively.The coefficients of variation (CVs) of both inter-assay and intra-assay repeatability were less than 2.0%,showing good repeatability.The assay was able to specifically detect NiV and HP-PRRSV simultaneously without cross-reaction with classical swine fever virus (CSFV),porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),swine influenza virus (SIV),porcine parvovirus (PPV),pseudorabies virus (PRV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).Of the 236 samples from pigs for both NiV and HP-PRRSV detection by the established assay,all the samples were negative for NiV,8 samples were HP-PRRSV positive.In conclusion,this assay offers a useful approach for the differential detection of NiV and HP-PRRSV in clinical specimens from the pigs. 相似文献
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《畜牧与兽医》2016,(6):126-129
参考Gen Bank中猪捷申病毒(PTV)基因序列,通过比对分析,设计引物和Taq Man探针,建立荧光定量RT-PCR检测方法。该方法的最低检测灵敏限度为12.6拷贝/μL,组内组间重复试验的变异系数均小于2%,具有较好的特异性,对猪常见病原如猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和伪狂犬病病毒等均没有特异性扩增。用本研究建立的荧光定量RT-PCR方法检测来自猪场的156份猪粪便,阳性检出率为38.5%,与套式RT-PCR符合率达100%,表明本试验建立的荧光定量RT-PCR方法适用于PTV的快速批量筛检,为PTV感染的流行病学调查提供了必要的技术手段。 相似文献
80.
为了建立一种快速、特异性强且敏感性高的兔源强毒力金黄色葡萄球菌检测方法,本试验根据金黄色葡萄球菌pvl基因的保守序列设计了特异性的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法耗时短,仅需约50 min就能完成检测,较已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法均省时;该方法特异性强,对兔源低毒力金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大肠杆菌和阴性对照(灭菌ddH2O)均无交叉反应;该方法敏感性高,最低检测限为10拷贝/μL,分别是已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的1 000倍和10倍。此外,该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。应用该方法检测126份已知结果的临床样品,检测结果与已知结果、已报道的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的检测结果完全一致。该方法的建立不仅丰富了兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测方法,也为该菌的快速检测提供了更有力的技术支持。 相似文献