喷雾荧光示踪剂回收率影响因素实验

荧光剂作为喷雾实验常用的示踪剂,其回收率对实验结果的准确性至关重要.设计了荧光示踪剂回收率影响因素的实验方案,用若丹明WT和荧光素钠作为荧光示踪剂,分别在不同稀释液和洗取液、气象条件、遮盖率、采样时间和沉积载体上测试荧光示踪剂回收率的变化情况.结果表明,在单因素试验中,其他条件相同的情况下,若丹明WT在典型阴天的回收率较高;荧光示踪剂回收率随遮盖率增加而增加;随采样时间增加而降低;滤纸更适宜作为沉积载体.     

免疫组化技术在病原微生物检测中的应用

免疫组织化学技术(immunohistoehemistry technique,IHCT)简称免疫组化技术,又称免疫细胞化学技术,是指在组织细胞原位通过抗原-抗体反应和组织化学的显色反应,借助可见的标记物,对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法.20世纪40年代,Coons应用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌在肺组织内的分布,从而开创了组织化学的新篇章.     

基于FDA-PI双荧光复染法的茄病镰刀菌孢子活性检测

【目的】茄病镰刀菌（Fusarium solani）孢子活性的检测是病害有效防控的基础。传统的孢子萌发法操作复杂,耗时费力,需要建立一种简便、快速的孢子活性检测方法。研究旨在建立基于荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate,FDA）-碘化丙啶（propidium iodide,PI）双荧光复染法和流式细胞术（flow cytometry,FCM）的茄病镰刀菌孢子活性检测技术。【方法】通过测定FDA和PI的最佳染色时间和最佳工作浓度,建立茄病镰刀菌孢子活性检测的FDA-PI复染法。为评价该方法的准确性,一方面用FDA-PI法检测已知死孢子比例（0、25%、50%、75%、100%）的茄病镰刀菌样品,分析实测死亡率和理论死亡率的相关性;另一方面,经物理、化学和杀菌剂处理后,比较FDA-PI复染法和孢子萌发法的检测结果。【结果】确定了FDA和PI的最佳染色参数,其中PI的最佳工作浓度为3 µg·mL^-1,最佳染色时间为4℃处理10 min;FDA的最佳工作浓度为100 µg·mL^-1,最佳染色时间为25℃处理20 min。用该技术检测已知死孢子比例样品,各样品实测孢子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关（R²=0.99,P＜0.05）。经物理和化学处理后,FDA-PI复染法测得的孢子死亡率与孢子萌发法测得的孢子萌发率之间也呈显著负相关（R²=0.99,P＜0.05）。经杀菌剂处理后,随着药剂浓度增高,对茄病镰刀菌杀灭效果增强。其中,氰胺化钙处理后,FDA-PI复染法和孢子萌发法检测孢子死亡率结果一致;而咯菌腈和多菌灵处理后,FDA-PI复染法检测孢子死亡率略低于孢子萌发法检测结果。【结论】建立了基于FDA-PI复染法和流式细胞术的茄病镰刀菌孢子活性检测技术,该技术可以替代传统的孢子萌发方法,大幅度缩减病原菌活性检测时间,提高检测效率,对植物病原真菌活性检测平台的建立具有重要的参考价值,将其应用于杀菌剂的筛选还需要进一步的深入研究。     

关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响

【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1,Myf5,MyoG和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中, MyoD基因家族会被抑制。该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达情况,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1（+）和pGL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析 MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD后,pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200 ng时增强作用最强,差异显著(P＜0.05);转染pcDNA3.1（+）-MyoG后,虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P＞0.05);而转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG后,pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显 (P＞0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05);而外源过表达转录因子 MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。     

镁碱度对土壤微生物活性和养分含量的影响

从10个具有不同镁碱化程度的采样点,采集土壤样品30个,测定土样pH、镁碱度、Mg2+/Ca2+、HCO3-+CO32-、钠碱度、有机碳、全氮、微生物生物量碳、荧光素二乙酸酯水解率、速效养分等指标。结果表明,镁碱化盐渍土有机碳、全氮、微生物生物量碳、微生物熵、荧光素二乙酸酯水解率、NH4+-N、NO3--N、速效磷等指标都与镁碱度和Mg2+/Ca2+显著负相关,表明镁碱化会造成土壤有机质含量降低、微生物群落变小、微生物活性下降、全量和速效养分含量偏低,镁碱化是导致土地生产力低下的原因之一。     

根结线虫活体染色条件的优化

【目的】为了提高根结线虫的成活率。【方法】以番茄和南方根结线虫为试验材料,对根结线虫二龄幼虫(J2)进行荧光标记,改进标记溶液浓度,进行染液浓度梯度和染色时间的筛选,确定最佳的染液浓度和染色时间,在保证线虫有效标记的前提下,不影响线虫的活力和致病性,深入了解线虫的行为。【结果】FITC:0.025mg/mL、0.25%间苯二酚、15mol/L章鱼胺盐酸盐缓冲液浓度下标记3h,线虫可以保持活力,入侵植株。【结论】该方法降低了染液浓度,缩短了染色时间,减少试剂用量,增加了线虫的存活率。     

长期施肥土壤的FDA水解酶活性

以长期不同施肥处理土壤为研究对象,运用荧光素二乙酸酯(FDA)为底物,采用分光光度法测定土壤FDA水解酶活性.结果表明:在黑土和棕壤上有机肥配施化肥处理的FDA水解酶活性增幅较大,相对于不施肥处理分别增加68.8%和72.4%,也显著高于单施化肥处理;土壤FDA水解酶活性与土壤微生物量碳具有极显著的正相关关系,在黑土和棕壤中相关系数分别为0.912**和0.871**;FDA水解酶活性能较好地反映微生物活性,可以作为评价土壤微生物量和活性的重要指标;同时,土壤FDA水解酶与参与C、N、P、S等重要养分循环的酶活性关系密切,均达到极显著水平.     

热研4号王草原生质体的制备

开展原生质体融合育种以及利用原生质体瞬时表达系统进行分子生物学实验的前提和基础是建立高效、有活力的原生质体制备体系。为建立热研4号王草原生质体制备体系,本研究以热研4号王草叶片为原生质体制备的外植体,将切成细丝的热研4号王草幼叶置于含2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶Y-23+0.5%崩溃酶+0.6 mol/L甘露醇+40 mmol/L KCl+6 mmol/L MES,p H 5.7+20 mmol/L Ca Cl2+0.15%BSA的酶液中,在避光条件下置于50 r/min的摇床酶解6~8 h,获得了大量有活力且均匀一致的原生质体。经过荧光素双醋酸酯(fluoresceindiacetate,FDA)染色和Western blot检测目的蛋白表达,结果发现采用酶解法制备的热研4号王草原生质体活力可达75%,且可用于表达拟南芥外源蛋白。本研究可为下一步利用热研4号王草开展分子生物学研究奠定基础。     

毛皮动物绿脓杆菌病的诊治

绿脓杆菌病又称出血性肺炎,是由绿脓假单胞菌(又称绿脓杆菌)引起的以出血性肺炎和肺水肿病变为特征的,高度接触性急性传染病。水貂、貉、狐等动物均易感。绿脓杆菌广泛分布于土壤、水、空气以及动物的肠道内和皮肤上。该菌是动物体内在菌,为条件致病菌,机体抵抗力降低时,可引起感染。本菌能产生水溶性的绿脓素和荧光素,可使培养物和     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。