TNF-α对猪脂肪细胞脂肪分解及其相关基因转录表达的影响

为探讨TNF-α对猪脂肪细胞脂肪分解的调控作用及其机制,用1、10、100 ng·m-1种剂量TNF-α作用体外培养的猪原代脂肪细胞24 h,及10 ng·mL-1TNF-α处理脂肪细胞1、6、12、24、48 h.使用甘油试剂盒,检测细胞甘油的释放量,RT-PCR检测ATGL、TGH-2、HSL、LPL、MGL和perilipinA表达量变化.结果表明,TNF-α以浓度和时间依赖性的方式促进猪原代脂肪细胞甘油的释放(P<0.05);同时下调ATGL、TGH-2、HSL、LPL、MGL和perilipin A mRNA表达量.说明:TNF-α主要通过下调perilipin A的表达,降低其对脂滴的保护作用,增加脂肪分解酶和脂滴的接触,促进了猪脂肪细胞的脂解作用.     

王宁教授主持的国家自然基金面上项目通过验收

<正>王宁教授主持的国家自然基金面上项目《鸡脂肪细胞分化负调控转录因子的高通量分离与功能验证》,主要内容是无菌采取10日龄肉仔鸡腹部脂肪组织,胶原酶消化法培养鸡前脂肪细胞,油酸诱导分化。采用高通量基     

罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的影响

[目的]探讨罗格列酮和血清对猪前脂肪细胞诱导分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的影响。[方法]利用胶原酶消化法分离了猪皮下前脂肪细胞,采用3种不同分化培养液对猪前脂肪细胞进行了诱导分化,借助油红O染色提取法比较了不同分化培养液对分化过程中细胞内脂肪含量变化的影响,并运用实时定量RT-PCR方法检测了不同分化培养液细胞分化过程中PPARα和PPARγ基因表达的变化趋势。[结果]细胞内脂肪聚积以含罗格列酮的MⅡ最快,不含罗格列酮的MⅠ最慢。罗格列酮可极显著上调PPARγ基因的表达（P〈0.01）,而对PPARα基因的表达存在一定的抑制作用,但不显著。血清对PPARγ基因的表达有极显著的上调作用（P〈0.01）,而对PPARα基因的表达有极显著下调作用（P〈0.01）。[结论]罗格列酮可极大地促进PPARγ基因的表达,继而增进细胞内脂肪沉积;血清中可能存在PPARγ基因的激活剂,同时存在PPARα基因的抑制因子。     

BMP2对猪前体脂肪细胞差异表达miRNA1的影响

采用高通量测序技术构建经骨形态发生蛋白-2(BMP2)处理前后的猪前体脂肪细胞差异miRNA表达谱,以明确BMP2影响的功能性miRNA。结果显示:BMP2刺激猪前体脂肪细胞前后共有55个miRNAs存在较大的表达差异,包括30个上调表达的miRNAs和25个下调表达的miRNAs;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,高通量测序数据结果正确可靠;经miRnada和RNAhybrid这2个软件对差异表达的miRNAs进行靶基因预测及靶基因进行GO和KEGG Pathway分析,发现靶基因主要富集在Notch信号通路、胰岛素信号通路、甘油磷酯代谢、MAPK信号通路、半乳糖代谢、类固醇激素的生物合成等通路。结果表明:BMP2作为前体脂肪细胞分化重要调控因子,可能通过介导miRNA及其调控的某些关键基因的表达,从而影响前体脂肪细胞外基质与受体的结合、胰岛素利用、脂类和糖的合成与代谢等生物学过程,最终作用于前体脂肪细胞的分化和脂质沉积。     

简州大耳羊肌内脂肪细胞成脂分化差异表达基因的筛选与鉴定

旨在通过转录组测序技术获得简州大耳羊肌内前体脂肪细胞成脂分化前后的差异表达基因,并经生物信息学分析获得相关信号通路及可能发挥作用的关键功能候选基因。本研究以7日龄的健康简州大耳羊公羊为试验动物（n=3）,采用胶原酶消化法分离获得其肌内前体脂肪细胞;利用Illumina平台对肌内前体脂肪细胞和诱导分化5 d的肌内脂肪细胞cDNA样品（n=3）进行高通量测序;以|log₂fold change|>0和P<0.05为阈值筛选获得差异表达基因,并利用clusterProfiler R包对其进行GO功能和KEGG通路富集;最后利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）技术检测功能候选基因在细胞分化前后的表达量变化。结果显示,共获得差异表达基因7 916个,其中4 143个为表达上调基因,主要富集到氧化磷酸化、核糖体合成和三羧酸循环通路等305条通路;3 773个为表达下调基因,且主要富集到甲状腺激素信号通路等303条通路;差异基因GO功能注释中52.8%为生物过程、13.4%是细胞组成和33.8%是分子功能。qRT-PCR结果表明,UCP3、ACACB、ACOT11、ACOX3、APOA1和WISP2在分化前后的山羊肌内脂肪细胞中的表达趋势与RNA-seq结果一致,提示这些基因适合作为下一步研究的功能候选基因。本研究筛选得到简州大耳羊肌内脂肪细胞成脂分化的差异基因,并确认了6个基因可作为功能候选基因。研究结果为阐明肉用山羊肌内脂肪细胞成脂分化的分子调控网络提供基础数据和系统资料。     

肾上腺素对民猪脂肪细胞基因表达模式的影响

为了探究冷刺激对民猪脂肪细胞代谢的影响,试验以体外培养的前脂肪细胞为试验材料,通过添加终浓度为1 000 nmol/L的肾上腺素模拟冷刺激环境,同时设置未添加肾上腺素的对照组,诱导分化7 d后收集细胞进行转录组测序(RNA-seq)分析,筛选出表达水平发生变化的差异基因,对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,最后通过qRT-PCR验证试验检测RNA-seq结果的准确性。结果表明：肾上腺素会改变脂肪细胞中基因的表达模式,引起128个基因显著上调,93个基因显著下调,其中游离脂肪酸受体4(FFAR4)基因上调倍数最大,为4.63倍。对差异表达基因进行GO功能注释,在分子功能注释分析中有8个条目显著富集,在生物过程注释分析中有128个条目显著富集,在细胞组分注释分析中无显著富集的条目。对差异基因进行KEGG信号通路富集分析,仅神经活性配体-受体相互作用通路被富集。说明肾上腺素可以改变脂肪细胞原有的代谢模式,与脂肪酸代谢和糖原合成等相关的基因发生了显著变化,同时细胞内外的信号转导也发生了改变。     

miR-106b-5p靶向KLF4调控山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在明确miR-106b-5p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向KLF4来实现的。本研究利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术检测miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，通过脂质体转染技术将miR-106b-5p mimic和miR-106b-5p inhibitor转入体外培养的山羊肌内前体脂肪细胞，油红O染色法从形态学验证miR-106b-5p对脂肪细胞中脂滴积聚的影响，qRT-PCR检测预测的靶标基因KLF4和脂肪分化标志基因的表达情况，利用双荧光素酶报告系统鉴定miR-106b-5p与KLF4的靶标关系。qRT-PCR结果显示，miR-106b-5p在山羊肌内前体脂肪细胞诱导分化第3天时表达量最高。在山羊肌内脂肪细胞中干扰miR-106b-5p后油红O染色显示脂滴聚积减少，过表达miR-106b-5p后脂滴聚积增加。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染miR-106b-5p inhibitor后PPARγ表达量显著降低（P<0.05），而KLF4表达量极显著升高（P<0.01）；转染miR-106b-5p mimic后LPL和PPARγ表达量极显著升高（P<0.01）。荧光素酶活性试验结果显示，过表达miR-106b-5p可显著抑制KLF4荧光活性。miR-106b-5p通过靶向并负调节KLF4的表达促进山羊肌内脂肪细胞分化。     

ADD1基因多态性位点与猪肌内脂肪含量、嫩度及背膘厚的关联性研究

将82头藏猪和84头其他品种猪屠宰后测定背膘厚,采集背部最长肌测定肌内脂肪含量和嫩度。采集血样提取DNA,利用PCR-RFLP分析ADD1基因的基因型,发现藏猪和其他猪种中均能检测到三种基因型AA、AB和BB。三种基因型的肌内脂肪含量和嫩度存在差异(P<0.05),而背膘厚不存在差异(P>0.05)。ADD1基因在藏猪和其他猪种中存在多态性位点,可以作为肌内脂肪选育的标记辅助选择位点。     

SRSF10对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响

旨在克隆山羊SRSF10基因序列,明确其生物学特性,并通过过表达和干扰手段阐明SRSF10对山羊肌内脂肪细胞分化的影响。本研究以简州大耳羊(Capra hircus)为试验对象,利用RT-PCR技术克隆山羊SRSF10基因序列,并进行生物信息学分析; 利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术研究其在成脂诱导分化不同阶段细胞中的表达水平; 转染pcDNA3.1-SRSF10过表达载体和SRSF10-siRNA至山羊肌内前体脂肪细胞并诱导分化,通过油红O和Bodipy染色法从形态学上明确其对脂滴积聚的影响; 通过qPCR方法检测脂肪细胞分化标志基因表达的变化。结果显示,获得山羊SRSF10基因序列为1 026 bp,其中CDS区552 bp,共编码183个氨基酸; SRSF10在诱导分化96 h的肌内脂肪细胞中表达量最高; 过表达和干扰山羊SRSF10分别促进和抑制了肌内脂肪细胞中的脂滴积聚; 过表达后基因SREBP1、PPARγ和C/EBPα的相对表达量极显著上调(P < 0.01),干扰后分化标志基因SREBP1、PPARγ和C/EBPα相对表达水平极显著降低(P < 0.01)。结果表明,山羊SRSF10是肌内脂肪细胞分化的正调控作用因子,并且这种调控作用可能主要通过调节SREBP1、PPARγ和C/EBPα的表达来实现。     

烟酰胺削弱罗格列酮诱导猪前体脂肪细胞凋亡的作用与分子机制

【目的】探讨烟酰胺（nicotinamide, NIC）和罗格列酮（rosiglitazone, RSG）对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及分子机制,寻找通过凋亡方式调控脂肪细胞数目进而控制生脂的新途径。【方法】分别用含有 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol•L-1 RSG的培养基处理猪前体脂肪细胞,在处理后的48 h,对不同处理组细胞进行Hoechst33258和Annexin-V-FITC/PI染色以观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白,用Western blotting方法检测细胞凋亡关键基因的蛋白表达水平;基于RSG促凋亡的浓度梯度结果,选用1.0 mmol•L-1 RSG分别与含0、0.1、0.2和0.3 mmol•L-1 NIC的培养基共处理细胞,在处理后的48 h,染色并观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,检测细胞凋亡关键基因的蛋白水平。【结果】 RSG以浓度依赖方式诱导猪前体脂肪细胞凋亡,减少了细胞数目;Bcl-2和cleaved Caspase-3凋亡关键蛋白水平随RSG浓度增加而上升,Bax则下降;0.1（P＜0.05）、0.2（P＜0.01）和0.3 mmol•L-1 （P＜0.01）NIC显著削弱1 mmol•L-1 RSG诱导猪前体脂肪细胞凋亡,Bcl-2和cleaved Caspase-3水平显著被下调（P＜0.05）,Bax则被上调（P＜0.05）;0.3 mmol•L-1 NIC明显有助于1 mmol•L-1 RSG处理的猪前体脂肪细胞中的Sirt1由细胞质向核转移,且抑制核中cleaved Caspase-3水平。【结论】NIC通过促进Sirt1由细胞质到核的转位以及下调核中cleaved Caspase-3水平削弱RSG诱导的猪前体脂肪细胞凋亡。