大肠埃希菌不耐热肠毒素作为黏膜免疫佐剂的研究进展

免疫佐剂是一类通过刺激机体免疫系统而非特异性地增强机体对抗原免疫应答的活性物质,也是近年来研究的热点.免疫佐剂种类众多,利用细菌及其代谢产物作为黏膜免疫佐剂具有很好的发展前景,研究较多的是霍乱毒素(CT)和大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT),从研究效果看,LT比CT更为理想.但是LT和CT一样本身具有毒性,这是其作为黏膜佐剂的主要缺点.目前,国内外研究工作者对其突变体做了大量研究,以期找到具有黏膜佐剂活性但低毒或无毒的大肠埃希菌不耐热肠毒素突变体.文章对大肠埃希菌不耐热肠毒素分子及其突变体的研究做一综述.     

集约化猪场PWD病原性大肠杆菌毒力因子分析

探索浙江省集约化猪场仔猪断奶腹泻(PWD)病原性大肠杆菌血清型和毒力因子特征,为PWD防治及耐药性研究提供资料.从10个规模化猪场以直肠棉拭子采集PWD病料,经细菌分离纯化、革兰氏染色、生化试验和小鼠致病性试验等,对病原进行鉴定.采用11种猪源大肠埃希氏茵常见O型抗原血清、应用K88及F18菌毛单因子血清对分离茵进行玻板凝集试验和PCR方法分析黏附素及肠毒素类型.分离鉴定的56株病原性大肠杆菌O抗原定型了33株,共覆盖了11种血清型,其中O149、O139、O8为优势血清型,共17株,占定型菌株的51.5%;茵毛单因子血清玻板凝集试验和PCR测得病原性大肠杆菌中产肠毒素大肠杆菌(ETEC)比例较高,占病原性大肠杆菌分离总数的67.92%(36/53),肠毒素中含STa、STb、STa+STb、LT和SL-2e分别占总检测菌株数的30.19%(16/53)、35.85%(19/53)、18.9%(10/53)、1.89%(1/53)和9.43%(5/53).黏附素类型主要有K88和F18两种,分别占总检测菌株数的24.53%(13/53)和28.30%(15/53).结果表明,浙江省PWD病原性大肠杆菌至少覆盖了包括优势血清型O149、O139、O8在内的11种血清型;大肠杆菌中以产肠毒素型为主,主要毒力因子包括黏附素F18及K88和肠毒素STa、STb、SLT-2e等.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

中药卵黄免疫球蛋白复合制剂防治仔猪大肠杆菌性腹泻

产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)是仔猪腹泻病的最常见病原。该菌引起的仔猪腹泻对仔猪成活率和后期增重都具有严重影响,成为制约养猪业发展的重要疾病。研制用于防治该病的中药卵黄免疫球蛋白复合制剂具有重要的实用价值。本研究用ETEC K88菌株C83907对120日龄待开产蛋鸡进行免疫,收集高免蛋制得特异性卵黄免疫球蛋白粉。将中药提取物、卵黄免疫球蛋白粉、大豆低聚糖按4.5∶4.5∶1.0(质量比)制成中药卵黄免疫球蛋白复合制剂。选用3日龄和21日龄的杜×长×大三元杂交早期断奶仔猪,人工感染C83907大肠杆菌,口服中药卵黄免疫球蛋白复合制剂进行保护试验。结果显示:3日龄仔猪服用中药卵黄免疫球蛋白复合制剂后,平均日增重接近不攻毒对照组(P0.05),但显著高于卵黄免疫球蛋白组、普通卵黄粉组、攻毒阳性对照组和中药组(P0.05);仔猪死亡率中药卵黄免疫球蛋白复合制剂组显著小于卵黄免疫球蛋白组和纯中药组(P0.05)。21日龄仔猪服用中药卵黄免疫球蛋白复合制剂组,平均日增重高于纯中药组(P0.05),卵黄免疫球蛋白组平均日增重显著高于纯中药组(P0.05)。临床应用效果显示,喂以6 g和10 g中药卵黄免疫球蛋白复合制剂组与抗生素治疗组的治愈率差异不显著组(P0.05),卵黄免疫球蛋白组和纯中药组治愈率差异不显著(P0.05);喂以6 g和10 g中药卵黄免疫球蛋白复合制剂组的治愈率均显著优于单一使用纯中药组和卵黄免疫球蛋白组(P0.05)。表明中药与卵黄免疫球蛋白联合应用具有增效作用,为防治产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)引起的仔猪腹泻提供了新途径。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

三丁酸甘油酯对产肠毒素大肠杆菌K88诱发的小鼠肠道损伤的缓解作用

本试验旨在研究三丁酸甘油酯(TB)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用。试验1：选用(20±2) g的BALB/c小鼠50只,随机分为5组,每组10只。各组均饲喂基础饲粮,在第4天对照组腹腔注射0.5 mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS),试验组腹腔分别注射浓度为5.5×10⁸、4.9×10⁷、4.0×10⁶、6.5×10⁵CFU/mL的ETEC K88悬液0.5 mL,连续观察3 d临床症状,统计腹泻率和死亡率,剖检、观察肠道病理变化,确定ETECK88最佳造模剂量。试验2：选择(20±2) g的BALB/c小鼠105只,随机分为7组,每组3个重复,每个重复5只。空白组、阴性对照组饲喂基础饲粮,阳性对照组饲喂添加0.16%金霉素的饲粮,试验1、2、3、4组分别饲喂添加0.05%、0.10%、0.20%、0.30%TB的饲粮。连续饲喂14 d,在第15天空白组小鼠腹腔注射0.5 mL无菌PBS,阴性对照组、阳性对照组和试验组小鼠按照试验1中确定的最佳造模剂量腹腔注射ET...     

饲粮添加迷迭香酸对产肠毒素大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪结肠菌群组成、屏障功能及炎症反应的影响

本研究旨在探究饲粮添加迷迭香酸（RA）对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)攻毒断奶仔猪结肠菌群组成、屏障功能及炎症反应的影响。选取18头体重为（6.91±1.02） kg的健康21日龄断奶仔猪,随机分为对照组（CON组）、攻毒组（K88组）和迷迭香酸组（RA组）,每组6头仔猪。CON组和K88组每天饲喂基础饲粮,RA组每天饲喂含RA的试验饲粮（在基础饲粮基础上添加500 mg/kg RA）。试验第19～20天,K88组、RA组仔猪每天灌喂4 mL浓度为109CFU/mL的ETEC K88重悬液攻毒,对照组仔猪则每天灌喂同等剂量的无菌生理盐水。所有仔猪在试验第22天屠宰取样。结果显示：1）与CON组相比,K88组断奶仔猪腹泻指数显著增加（P<0.05）;与K88组相比,RA组断奶仔猪腹泻率极显著降低（P<0.01）。2）与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠隐窝深度和黏膜厚度极显著降低（P<0.01）。3）与CON组相比,K88组断奶仔猪结肠菌群Chao1和ACE指数显著降低（P<0.05）。4）在门水平上,与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠菌群中拟杆菌门（B...     

大肠杆菌热敏肠毒素对猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力及细胞因子表达的影响

本试验旨在探究大肠杆菌热敏肠毒素处理(heat labile enterotoxin,LT)后,猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力及细胞因子ET-1、IL-1β水平的变化。首先采用D-半乳糖凝胶树脂层析法提取猪E coli LT,利用SDS-PAGE验证蛋白纯度,并用Vero细胞检验提取物的生物学活性,最后采用CCK-8法检测LT对猪小肠黏膜微血管内皮细胞活力的剂量时间效应,ELISA法检测细胞培养上清中ET-1、IL-1β水平的变化。结果表明:所提蛋白为AB_5结构的LT,且具有良好的生物学活性;0.01 mg/L的提取蛋白作用3 h后便可显著降低小肠黏膜微血管内皮细胞的活性(P0.05);作用细胞6 h后,0.01,0.1和10 mg/L LT组细胞培养上清中ET-1的含量显著升高(P0.05),0.01和1 mg/LLT组IL-1β的含量显著升高(P0.05)。结果表明,E coli LT可以显著改变猪小肠黏膜微血管内皮细胞的活力及细胞因子的表达。     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTR72的表达与鉴定

将重组质粒PLTR72和PLT分别转化大肠杆菌JM101，DH5α和C600，并接种于LB和CAYE-2中培养，用GM1-ELISA法检测菌体裂解液中2者的表达情况，将表达产物纯化后用SDS-PAGE等方法鉴定。结果表明，3种大肠杆菌在2种培养基中都可表达出LT突变体和LT，并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中，成为具有GM1结合活性的突变体蛋白，鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型LT相同。均是1A：5B。