大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

对已构建的重组质粒ｐＸＳＴ１进行了核苷酸序列分析和免疫原性研究。序列分析结果表明，该粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫实验结果表明，构建的ＤＨ５α重组菌株安全无毒。     

不耐热性肠毒素的黏膜免疫佐剂效应及其应用

黏膜免疫和黏膜免疫佐剂是近年来发展起来的新的免疫理论和新型技术，已成为医学界和免疫学界的研究热点。人们发现，虽然绝大多数病原微生物的感染始发于黏膜部位(呼吸道、消化道、尿道和生殖道)，但是在动物和人群中暴发传染病的数量都相对较低，部分原因就在于感染局部和全身免疫系统会产生多种免疫球蛋白来抵抗感染。不耐热性肠毒     

猪源产肠毒素大肠杆菌eltA、flhD、fimA、faeG基因启动子的预测、克隆和鉴定

猪源产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原菌之一,其致病机制与染色体上特定的毒力岛以及毒力质粒上的某些毒力基因相关。基于对ETEC毒力因子的前期研究,本研究初步预测并鉴定了eltA基因(编码LT毒素A亚单位)、flhD基因(编码鞭毛系统一级调控子)、fimA基因(编码I型菌毛主要结构亚基)和faeG基因(编码K88菌毛主要结构亚基)的启动子位置。通过构建含eltA、flhD、fimA、faeG基因启动子的LacZ报告质粒,利用β-半乳糖苷酶试验检测其活性,为进一步定位启动子、确定启动子序列,探索猪源ETEC毒力调控关系,了解细菌感染过程中各毒力因子的表达规律奠定试验基础。     

K88菌毛基因的克隆及ST表位序列在菌毛基因上的融合

[目的]为了建立用于细胞表面展示的载体系统。[方法]利用PCR技术,以大肠杆菌质粒为模板扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC~faeH,并克隆到pBR322质粒载体中。合成一段替换序列,在菌毛抗原基因的超变区引入酶切位点ApaI和NcoI,合成耐热肠度素STII表位编码序列,并引入菌毛抗原基因的超变区。[结果]经PCR鉴定和限制性内切酶酶切证明,重组质粒pBR-fae插入片断大小为6.6kb,与预期相符。核苷酸序列分析证明,所得faeC~faeH序列正确。PCR筛选和测序验证证明,构建了K88菌毛-耐热肠度素STII的融合基因。[结论]试验成功获得了重组质粒pBR-fae-ST。     

暗纹东方鲀非01霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测

在对养殖暗纹东方病害调查中，从呈典型症状病鱼腹腔和肠道粘液中分离到2株（J-1和H-3）菌株，经生化特性和血清型鉴定为非01群霍乱弧菌(Non-01 Vibrio cholerae)。注射、创伤和浸泡3种方式进行人工感染试验表现出较强的致病性，出现症状与自然发病鱼相同。为进一步确认分离菌株的分类地位，使用P1、P2引物，以非01群霍乱弧菌N92001菌株和01群霍乱弧菌N16961菌株为对照，对分离菌株进行PCR扩增，得到451bp的DNA片段。根据现有霍乱弧菌肠毒素ctxA基因序列设计引物P3,P4，以N16961菌株为阳性对照，PCR扩增结果均得到大小为400 bp的DNA片段。在对H-3菌株的扩增片段进行纯化、克隆和测序，得到407bp序列，该菌株与N16961菌株中肠毒素ctxA基因序列的完全一致，证实该片段源于ctxA基因。进一步说明从暗纹东方体内分离到的J-1和H-3菌株具有霍乱肠毒素ctxA，有一定的致病力。     

魏氏梭菌肠毒素研究进展

魏氏梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体,可引起人的食物中毒和抗生素相关性腹泻(非食源性胃肠道疾病),肠毒素是该菌的一个非常重要的致病毒素,在引起人的胃肠疾病方面起着关键性的作用,作者针对魏氏梭菌肠毒素的生物学特性及分子生物学等方面的研究内容进行论述.