牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法，以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因，克隆至pGEM—T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21（DE3），在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定，gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后，Western-blotting和ELISA分析结果表明，这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应，可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

哺乳动物精清诱导排卵活性蛋白质研究

在动物的精清里包含一些与动物生殖生理活动密切相关的活性蛋白和多肽。驼科动物的双峰驼、美洲驼、羊驼和澳洲考拉等哺乳动物精清中含有类似促性腺激素释放激素(GnRH)作用的活性蛋白质,诱导排卵因子(ovulation inducing factor,OIF),它能引发外周血液中促黄体素(LH)峰浓度的出现和诱发母畜排卵。OIF被认为是一种新的生物活性蛋白质或潜在的新型激素。甚至报道在牛等自发排卵动物以及人精清中也存在类似的活性蛋白。这类因子的发现对于哺乳动物生殖生理及繁殖的深入研究具有重要的意义,有助于动物克服繁殖障碍及繁殖疾病的治疗等。     

金属硫蛋白提取工艺的研究进展

综述了金属硫蛋白提取工艺包括诱导、分离纯化和检测的研究进展。     

哺乳动物精清诱导排卵活性蛋白质研究

在动物的精清里包含一些与动物生殖生理活动密切相关的活性蛋白和多肽.驼科动物的双峰驼、美洲驼、羊驼和澳洲考拉等哺乳动物精清中含有类似促性腺激素释放激素(GnRH)作用的活性蛋白质,诱导排卵因子(ovulation inducing factor,OIF),它能引发外周血液中促黄体素(LH)峰浓度的出现和诱发母畜排卵.OIF被认为是一种新的生物活性蛋白质或潜在的新型激素.甚至报道在牛等自发排卵动物以及人精清中也存在类似的活性蛋白.这类因子的发现对于哺乳动物生殖生理及繁殖的深入研究具有重要的意义,有助于动物克服繁殖障碍及繁殖疾病的治疗等.     

马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏茵中表达及其多克隆抗体制备

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMC）中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素（Equine interferon-γ，EIFN-γ）基因，将其克隆至载体pCR2．1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒（pCR-EIFN-γ）中扩增马干扰素成熟蛋白（MatureEIFN-γ，mEIFN-γ）基因，并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明，mEIFN-γ基因全长为441b口，含一个开放阅读框，编码146个氨基酸的成熟蛋白；对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在，重组蛋白相对分子量约为18Ku，且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下，采用Ni^＋亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体，为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。     

珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化

为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。     

抗菌肽的抗菌机理及其应用

近10年来，随着动物及微生物抗菌肽理论与应用研究的逐渐深入，先后有Magainin（Bevins，等，1990），Nisin和Cecropins（Boman，1995）等抗菌肽在医药、工业、食品和农业中应用，抗菌肽独特的性质展示出广阔的应用前景。植物抗菌肽在分离纯化、抗菌特性、细胞毒性、理化性质以及转基因等许多方面的研究进展也很快，发现了一大批理化性质和抗菌特性各异的植物抗菌肽。同时近几年对昆虫抗菌肽、蛙抗菌肽、猪抗菌肽、鼠抗菌肽等的研究逐渐增多（郭玉梅，1997）。     

一株鸡源乳酸菌的分离与初步鉴定

从饲养青脚土杂鸡的嗉囊和盲肠内容物中作乳酸菌的分离和纯化，将纯化得到的菌株进行不同温度培养、发酵液pH值测定及一系列生化试验。结果表明：所分离的8株乳酸菌为同一菌属。初步鉴定为德氏乳杆菌属，实验室代号为S-5。     

禽流感H9亚型病毒WD株毒种的纯化研究

采用鸡胚终点稀释法并结合ND抗血清中和法对禽流感H9亚型病毒WD株毒种进行了纯化。将纯化的WD株毒种在SPF鸡胚连续传12代，对各代次毒种进行了毒价测定，选择一定代次的毒种进行了免疫原性试验及外源病毒检验。结果表明，WD株在鸡胚中连续传12代，其HA价稳定在1：512—1：1024，毒价在10^7.0-10^8.3 EID50／0．1mL；不同代次毒种不含外源病毒，免疫原性均符合要求。由此可见，毒种的纯化方法是有效的，将WD株毒种限制在12代内是可行的，并建立了该毒种的种子批。