花生转基因研究进展

同多数豆科作物一样，花生的基因转化技术难度大，且与主要粮食和经济作物相比起步晚，因此进展较慢。本文收集近几年的中外资料，时花生基因转化研究中植抹再生体系的完善过程及存在问题、目前用于转化的目的基因、主要转化方法的改进及转化基因的表达方面的研究进展进行了综述，并指出在花生基因转育中急待解决的问题或需要努力的方向，为进一步进行花生转育研究提供理论基础。     

pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建

对pBI121载体GUS基因后的终止子序列（Sac Ⅰ-EcoR Ⅰ）通过PCR扩增法进行了酶切位点的添加，即在SacⅠ后添加了XhoⅠ、在EcoRⅠ前添加了KpnⅠ。序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，但扩增的终止子序列与原序列的同源性间有差异，即有4个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现了缺失。利用绿色荧光蛋白（GFP）对添加酶切位点载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它与携带GFP的pBI121载体一样，GFP基因能正常表达，说明pBI121载体终止子序列酶切位点的添加是成功的。利用改造后的载体（pBI121-GZ）构建了CaMV35S启动子驱动AtNHX1基因的植物表达载体。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

拟南芥种皮色素形成机制的研究进展

类黄酮为拟南芥种皮的主要成色物质,其生物合成过程受到一系列基因的影响.这些基因中,一部分为结构基因(TT4、TT5、TT6、TT7、FLS1TT3,LDOX和BAN)编码一些酶类参与到类黄酮的生物合成;一部分作为调控基因(TT1,TT2,TT8,TTG1,TTG2和TT16)编码一些酶对生物合成途径起调控作用;另外一些基因(TT12,TT19)编码与色素转运、积累相关的蛋白质。这些基因中的一种或几种发生变异就能影响到类黄酮的生物合成,从而引起拟南芥种皮色泽的变异。在此,就拟南芥种皮的色泽变异及类黄酮生物合成机理作一介绍。     

白菜型油菜DFR基因的克隆与序列分析

By using RACE (rapid amplification ofcDNA ends) based homologous cloning strategy, we have successfully isolated the genomic and full-length cDNA sequences of a gene encoding typical DFR (dihydroflavonol-4-reductase) from black-seeded Brassica campestris L. var. oleifera DC.. The gene, designated BcDFR here, is 1 722bp in length and harbors 5 introns with typical splice sites of plant DFR genes. BcDFR cDNA is 1311bp in length with a 1 158bp ORF as well as a 25bp 5‘ UTR and a 128bp 3‘ UTR. The encoded BcDFR protein is 385 aa with a calculated Mw of 42.85kD and a pI value of 5.55. The nucleotide and amino acid sequences of this gene share extensive homologies to plant DFR genes of wide origins especially high similarities to Cruciferous DFR genes. Sequence analyses such as phylogenetic analysis, conserved domain search and substrate specificity region detection all indicated that BcDFR gene is a quite potentially biofunctional gene. Its cloning enables us to further dissect the possible relatedness between DFR gene and Brassica seed coat color traits and to create transgenic novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense- or RNAi-suppression of DFR gene expression in black-seeded elite cultivars.     

对Bt毒蛋白不同抗性水平棉铃虫品系的生物学研究

用对Bt毒蛋白(Cry1Ac)具有一定抗性水平的安阳品系和相对敏感的新疆品系棉铃虫进行Bt毒蛋白(Cry1Ac)的室内毒力测定结果表明,两品系的LC50值分别为8.7645g·L 1和0.2547g·L 1,前者是后者的34.4倍。用转Bt基因抗虫棉中棉所29和常规棉花品种中棉所35蕾期的倒3叶饲养安阳品系和新疆品系棉铃虫的初孵幼虫(孵化后24h),结果表明:两个棉铃虫品系在取食抗虫棉后的累计校正死亡率在1～2d内差异不明显;新疆品系棉铃虫在转Bt基因抗虫棉上发育的最高龄期为4龄,其比率为6.7%;而安阳品系部分棉铃虫能够在转Bt基因抗虫棉上完成生长发育,其4龄幼虫的比率为45.5%,5、6龄幼虫的比率分别为12.6%和3.8%,有1.6%的幼虫能够正常化蛹;用常规棉棉叶饲养的安阳品系和新疆品系棉铃虫各龄幼虫的发育历期差异不显著,而用转Bt基因抗虫棉棉叶饲养的安阳品系棉铃虫幼虫的发育历期与新疆品系虽然差异不显著,但前者的发育历期均短于后者。     

香蕉抗病基因类似序列(RGA)的克隆与分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料IN21(Musa spp.cv). 'IN21',AA)和Rose(M.spp.cv.'rose',AAA)的基因组DNA中扩增获得4个RGA,四条DNA片段长度分别为527 bp、537 bp、534 bp和547 bp,分别命名为"RGA-IN1"、"RGA-IN2"、"RGA-Rosel"和"RGA-Rose2"(GenBank Accession:EF488469、EF488470、EF488471和EF488472);同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因.     

国内外太空育种研究现状

太空育种，又称航天育种、空间诱变育种，是利用太空技术，通过高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物的种子、组织、器官或生命个体等诱变材料搭载到200～400km高的宇宙空间，利用强辐射、微重力、高真空、弱磁场等宇宙空间特殊环境诱变因子的作用，使生物基因发生变异，再返回地面进行选育，培育新品种、新材料的作物育种新技术。其核心内容是利用太空环境的综合物理因素对植物或生物遗传性的强烈动摇和诱变，在较短的时间内创造出目前地面诱变育种方法难以获得的罕见突变种质材料和基因资源，选育突破性新品种，由此开辟一条植物育种的新途径。     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.