口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

山东省菏泽市某规模猪场不同猪群伪狂犬病野毒感染情况调查

为了解规模猪场不同猪群的伪狂犬病病毒(PRV)感染情况及场区病毒载量分布特点,在山东省菏泽市某规模猪场,利用实时荧光定量PCR方法,对该猪场不同孕龄母猪、不同阶段生长猪群,以及各生产阶段场区环境,采集猪鼻拭子和场区环境拭子进行PRV-gE核酸检测,并对检测结果进行统计分析。结果显示:在294份猪鼻拭子中,检出42份PRV-gE核酸阳性,总阳性率为14.28%;母猪群PRV-gE阳性率为17.83%(23/129),且妊娠前后各阶段阳性率呈先上升后下降趋势,中期较高(24.00%),但差异不明显(P>0.05);不同阶段生长猪群的平均PRV-gE阳性率为11.52%(19/165),随日龄增加,阳性率也呈先上升后下降趋势,80~90日龄育肥猪最高(28.13%),与其他生长阶段猪群差异明显(P<0.05);除饲料、水源、上猪台和出猪台外,其他大部分场区环境均检测到PRV-gE核酸阳性;育肥猪群病毒载量最高,为3.6×105拷贝数/mL,其猪舍环境的病毒载量也较高,与其他环境及生长阶段猪群差异均明显(P<0.05)。结果表明,不同猪群包括免疫猪群均可遭受PRV野毒感染,尤其是母猪妊娠中期和猪育肥阶段早期,且大部分场区环境均可被污染。结果提示,规模猪场要加强各种猪群尤其是育肥猪群的伪狂犬病免疫,通过监测来调整和优化免疫程序,同时要加强生物安全,防止病毒传入和扩散。     

鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。     

口蹄疫病毒A型竞争ELISA抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用

为评价口蹄疫病毒A型竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用前景,对2017年从福建省三明市采集的336份黄牛、奶牛、羊和猪血清样品,用A型cELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。结果显示,92份黄牛血清、92份羊血清、92份猪血清、60份奶牛血清的A型抗体阳性率分别为13.04%、11.96%、20.65%、86.67%。从上述4种血清中,各挑选10份血清(阴性、阳性各5份)共40份,采用口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)抗体检测试剂盒进行验证。结果显示:cELISA检测为阳性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阳性19份;cELISA检测为阴性的20份血清中,用LPB-ELISA检出阴性17份;两种方法的κ值为0.8,总符合率为90.00%。结果表明,A型cELISA试剂盒与LPB-ELISA试剂盒的符合率和一致性均较高,可用于口蹄疫流行病学调查和血清学监测。     

妊娠后期营养限制对蒙古绵羊胎儿生物原胺类神经递质的影响

本试验旨在研究妊娠后期营养限制对蒙古绵羊胎儿生物原胺类神经递质的影响。选择健康、体况相近的蒙古绵羊18只,对其进行同期发情、配种后,从妊娠第90天开始,随机分为3个组:营养限制1组[NG1组,n=6,代谢能(ME)=0.175 MJ/(kg BW 0.75·d)]、营养限制2组[NG2组,n=6,ME=0.330 MJ/(kg BW 0.75·d)]和对照组[CG组,n=6,ME=0.670 MJ/(kg BW 0.75·d)],在妊娠第140天时屠宰,取各组胎儿及其脑组织和血液。结果显示:NG1组胎儿的脑重较CG组显著增高(P<0.05),并且NG1组胎儿脑中5-羟色胺(5-HT)(P<0.01)、肾上腺素(EPI)(P<0.05)含量显著或极显著高于CG组,去甲肾上腺素(NA)的含量极显著低于CG组(P<0.01)。NG2组胎儿脑中5-HT含量极显著高于CG组(P<0.01),而NA(P<0.01)、多巴胺(DA)(P<0.05)含量显著或极显著低于CG组。另外,NG1组胎儿血浆中5-HT(P<0.01)、EPI(P<0.01)、NA(P<0.05)、DA(P<0.01)含量显著或极显著低于CG组;NG2组胎儿血浆中5-HT(P<0.01)、NA(P<0.01)、DA(P<0.05)含量显著或极显著低于CG组。由此得出,妊娠后期营养限制使得蒙古绵羊胎儿脑中5-HT、EPI含量升高和NA含量降低,血浆中5-HT、EPI、NA、DA含量降低。     

云南省野猪源猪瘟病毒E2及5'NTR基因序列测定分析

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重危害我国养猪业健康稳定发展。本研究采用RT-PCR方法,对从云南省宁洱县2头病死野猪体内分离到的2株CSFV毒株进行了E2及5''NTR基因扩增、克隆及序列测定;采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件,对测得的序列与国内外参考毒株进行了同源性分析及系统发育分析。结果显示：2株野猪源CSFV株E2、5''NTR基因同源性分别为87.2%、100%,与国内外参考毒株同源性分别为81.0%~97.6%、93.6%~98.5%,与我国强毒株Shimen株的同源性分别为81.0%~81.2%、95.6%;2株野猪源CSFV毒株E2基因属于基因2.1亚型,5''NTR基因属于基因2.3亚型。氨基酸序列分析显示：其中一株分离毒株的E2基因有6个氨基酸具有2.1d分子变异特征,另一株兼有2.1d和2.1b亚型分支特征,可能是2.1b和2.1d亚型的过渡毒株。结果表明,云南省野猪源CSFV虽存在一定的遗传衍化,但总体比较稳定。本研究为云南省CSF防控提供了分子流行病学依据,为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。     

湖南省部分地区病猪和屠宰猪群猪圆环病毒感染状况调查

为了解湖南省猪圆环病毒（PCV）流行情况,采用荧光PCR方法,对来自湖南省14个市州的821份临床病料和屠宰场猪淋巴结样品进行PCV1、PCV2、PCV3和PCV4荧光PCR检测。结果显示：在821份样品中,PCV阳性检出率为88.06%（723/821）,阳性检出率由高到低依次为PCV2（81.49%）、PCV3（33.98%）、PCV1（8.04%）和PCV4（1.10%）;278个样品存在两种及以上的PCV混合感染,以PCV2+PCV3混合感染最多,占82.01%;在地域分布上,PCV1、PCV2、PCV3在湖南省各地区均有分布,而PCV4分布范围较小,感染率低。结果表明,湖南省内PCV流行较为普遍,4种基因型病毒都存在,但以PCV2流行最为广泛,需要加强防控。     

甘肃省天水市生猪屠宰企业非洲猪瘟检测能力提升措施

着力加强和提升生猪屠宰企业非洲猪瘟检测实验室建设是有效防范非洲猪瘟传播的重要手段。为进一步提升屠宰企业非洲猪瘟自检能力,对甘肃省天水市生猪屠宰企业非洲猪瘟自检体系建设和运行情况进行了实地调研,并针对不足之处提出系列提升指导措施。调研发现:2019年以来,通过优化实验室配置、增加检测人员数量、加强检测人员培训和强化生物安全防护措施等,天水市屠宰企业非洲猪瘟检测能力明显提升。本文为我国其他地区生猪屠宰企业提升非洲猪瘟自检能力提供了参考。     

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。     

新城疫病毒感染性克隆全长cDNA转录载体的构建

以pEGFP-N1和pAdTrack-CMV质粒为模板,通过PCR扩增分别获得GFP基因序列和Kan基因序列;以胶回收的目的序列为模板,通过Overlap PCR扩增获得GFP-Kan基因序列。回收GFP-Kan基因序列,插入至pCI-neo载体上,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-GFP/Kan。再将设计合成的linker基因序列通过酶切、连接克隆至pCI-GFP/Kan载体上,涂布Kan抗性平板进行阳性克隆筛选,酶切和测序鉴定正确的重组载体命名为pCI-infect,即为新城疫病毒全长cDNA双启动子克隆载体。酶切和测序鉴定结果显示,pCI-infect载体构建成功。