紫花苜蓿MsCIPK2的克隆及功能分析

【目的】CIPK是植物响应逆境胁迫信号通路中一类重要的蛋白激酶,可与CBL形成CBL-CIPK复合物,启动细胞内相关应答基因的表达而应对各种非生物胁迫。发掘并研究紫花苜蓿MsCIPK基因响应非生物胁迫的分子机理,有助于揭示紫花苜蓿抗逆生物学基础,为紫花苜蓿抗逆育种提供新的基因资源。【方法】通过PCR技术克隆MsCIPK2,使用生物信息学工具分析基因序列,利用qRT-PCR技术分析MsCIPK2,以及与其互作的4个CBL基因（MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10）在紫花苜蓿各组织中的表达水平,在烟草叶片表皮细胞中,瞬时表达pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2融合表达载体,通过激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位,利用酵母双杂交技术分析MsCIPK2与4个MsCBLs蛋白互作情况,利用发根农杆菌诱导紫花苜蓿产生过量表达MsCIPK2的毛状根,利用qRT-PCR技术分析转基因毛状根株系中相关基因的表达水平。【结果】通过PCR扩增获得MsCIPK2片段,该基因CDS为1 230 bp,编码409个氨基酸,具有典型的CIPK家族的ATP结合位点、激活环、NAF motif和PPI motif等结构域。MsCIPK2在紫花苜蓿根中表达量最高,在花中表达量最低。亚细胞定位结果显示,MsCIPK2蛋白定位于内质网。酵母双杂交试验结果显示,MsCIPK2蛋白与MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10蛋白具有相互作用,且与MsCBL10蛋白相互作用较强。MsCBL2、MsCBL6和MsCBL10在紫花苜蓿根中表达量最高,MsCBL7在荚中表达量最高。qRT-PCR结果表明,过量表达MsCIPK2的毛状根中响应非生物胁迫基因ATPase、P5CS、CYP705A5、COR47、HAK5和RD2的表达量均明显上调。在200 mmol·L^-1 NaCl和20%PEG处理条件下,与对照相比,过量表达MsCIPK2毛状根的丙二醛含量降低,SOD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量增高。【结论】紫花苜蓿MsCIPK2与MsCBLs蛋白互作,主要在根中表达并响应盐和干旱胁迫,过量表达MsCIPK2可以提高紫花苜蓿的耐盐性和耐旱性,MsCIPK2可作为提高紫花苜蓿抗逆育种的候选基因。     

西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的克隆及分析

旨在利用基因工程手段将AeSePAP1基因转入到小麦,为获得耐低磷胁迫的小麦品种奠定基础。以西尔斯山羊草的叶片为材料,根据小麦和二穗短柄草的PAP1基因设计特异引物,采用同源克隆的方法获得西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的cDNA序列,并将其命名为AeSePAP1。该基因长1.03kb,编码335个氨基酸,分子质量为37.95ku,等电点为5.55。与小麦PAP1基因相比,西尔斯山羊草PAP1基因的cDNA的编码区有36处发生碱基替代,包括24处转换和12处颠换,有16处编码的氨基酸残基不同,其序列一致性达94.66%。对AeSePAP1基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现,该蛋白具有信号肽和跨膜结构,定位于质膜或分泌到胞外。系统进化树分析表明,西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因与普通小麦、短柄草、谷子的PAP1基因同源性较高。     

解磷细菌氧化微杆菌Y8对枳的促生作用及其对土壤解磷相关功能基因的影响

以柑橘砧木枳（Poncirus trifoliata）为研究植株，以华南红壤柑橘园分离出的1株解磷细菌（phosphate solubilizing bacteria,PSB）氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）Y8为研究菌株，通过盆栽试验探究PSB Y8对枳生长以及土壤磷素、磷循环相关功能基因的影响及其潜在的解磷机制。结果表明：接种PSB Y8极显著增加了枳的生物量以及土壤中性磷酸酶活性；显著增加了土壤中与磷活化相关的碱性磷酸酶编码基因pho D的丰度，极显著增加了葡萄糖酸编码基因gcd的丰度；显著降低了土壤中无机磷中Al-P的含量，显著增加了有机磷总含量和MLPo含量，影响了土壤中不同磷素的转化。综上，PSB Y8的解磷机制可以归纳为其通过上调磷酸酶相关功能基因pho D的丰度，增加土壤磷酸酶活性，从而影响土壤磷素组分的转化，增加土壤有机磷和MLPo的含量，可能促进枳对磷素的吸收，进而增加枳的生物量。     

不同形式氮添加对草甸草原土壤磷素含量和碳氮磷化学计量特征的影响

由无机氮和有机氮沉降共同构成的大气氮沉降已成为全球变化的重要现象之一，影响着草原土壤磷循环过程。以内蒙古额尔古纳草甸草原为研究对象，进行了5年不同形式氮添加试验，设置的无机氮和有机氮比例分别为10:0 (N₁)、7:3 (N₂)、5:5 (N₃)、3:7 (N₄)、0:10 (N₅)和对照处理0:0 (CK)。通过测定土壤有效磷含量、全磷含量及酸性磷酸酶活性，结合生态化学计量学来探究不同形式氮添加对草甸草原不同土层磷素含量和碳氮磷化学计量特征的影响。结果表明，不同形式氮添加对土壤全磷含量和酸性磷酸酶活性无显著影响(P> 0.05);0-10 cm表层土壤有效磷含量在N₂处理下显著高于对照和其他氮添加处理(P <0.05)。土壤碳氮比(C/N)、碳磷比(C/P)、氮磷比(N/P)均不受氮添加形式的影响；0-10 cm表层土壤C/N、C/P、N/P均值低于全国平均水平。因此，有必要在更长的时间尺度上继续跟进不同形式氮添加对草原土壤磷循环的影响。     

金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）是植物蔗糖生物合成最后一步催化反应的关键酶，对调控植物生长发育不同时期的蔗糖合成过程有重要作用。为探索金柑（Fortunella crassifiolia Swingle）SPP基因及其编码蛋白的序列特征及其在果实发育过程的表达特性，本研究以四倍体品种脆蜜金柑（F. crassifiolia Swingle cv. Cuimi）为试验材料，采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆（RACE）方法从金柑果肉中克隆SPP基因，对其进行生物信息学和原核表达分析，并检测果实发育不同时期该基因在果肉中的表达量。结果表明，FcSPP基因的cDNA序列全长1 638 bp，最长开放阅读框（ORF）为1 191 bp，编码396个氨基酸，理论等电点为6.57，为稳定的亲水性蛋白，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。FcSPP蛋白含有S6PP和S6PP＿C保守结构域，属于植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。系统进化分析结果显示，FcSPP蛋白与甜橙SPP同源性最高，在进化树上与拟南芥等双子叶植物SPP划归为一类。此外，本研究构建了FcSPP基因的原核表达载体，诱导表达获得纯化的FcSP...     

三种投入品对克氏原螯虾抗氧化酶、丙二醛、磷酸酶和溶菌酶的影响

为研究CuSO₄、青苔净和草甘膦三种投入品对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)抗氧化酶等的影响，参考实际生产中使用浓度，设置对照、CuSO₄(1和2 mg/L)、青苔净(5和10μg/L)和草甘膦(5和10μg/L)实验组，分别在4、8和12 d时测定肝胰腺抗氧化酶类物质[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC)]、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、酸/碱性磷酸酶(ACP/AKP)和溶菌酶(LZM)的活性及丙二醛(MDA)的含量。结果显示：三种投入品均造成克氏原螯虾肝胰腺抗氧化酶(SOD、CAT、GSH、GPx)活性先升高后降低，T-AOC活性持续下降；青苔净和草甘膦造成GR活性先升高后降低，也造成MDA含量先降低后升高；CuSO₄造成MDA含量先升高后降低；三种投入品处理后期造成磷酸酶(ACP和AKP)活性升高，LZM活性降低。结果表明三种投入品均会造成克氏原螯虾肝胰腺抗氧化防御因子活性水平、磷酸酶活性、MDA含量和LZM...     

青稞酸性磷酸酶基因HvnACP2克隆和亚细胞定位研究

为了探索青稞酸性磷酸酶基因 HvnACP2的基因和蛋白结构特点，为青稞磷吸收利用机制研究提供基础。以青稞‘肚里黄’叶片为材料，根据植物基因组数据库Gramene中的大麦 HvACP2基因和启动子区域序列设计引物，通过PCR获得青稞 HvnACP2基因和启动子区域序列。采用生物信息学软件对 HvnACP2基因启动子区域元件以及蛋白理化性质、跨膜结构、磷酸化位点、信号肽、二级、三级结构进行分析。结果表明： HvnACP2有2个外显子和1个内含子，启动子区域有与分生组织、光响应、厌氧、茉莉酸和脱落酸相关的顺式作用元件。HvnACP2蛋白由454个氨基酸组成，分子质量为51 285.15 u,总原子数为7 058,亲水系数为-0.451,理论等电点为6.17,不稳定指数34.54,脂溶性指数为67.05。具有12个磷酸化位点和信号肽，不具有跨膜结构。 HvnACP2中α螺旋、延长链、β转角、无规则卷曲所占比例分别为18.72%、53.96%、23.57%、3.74%。 HvnACP2和其他物种的同源蛋白都有紫色酸性磷酸酶N末端结构域和金属酸性磷酸酶结构域，将 HvnACP2与其他植物的氨基酸序...     

刺槐丛枝菌根酸性磷酸酶的细胞化学研究

对接种从枝菌根真菌摩西球囊霉（Glomus mosseae 的刺槐幼苗进行酸性磷酸酶的细胞化学定位。结果表明,菌根中菌丝和从枝细胞膜均有酶反应,丛枝顶端细胞膜酶反应更为强烈,同时诱导宿主细胞膜产生酶反应对照的菌根细胞内入侵菌丝和根细胞间隙中的菌丝无酶反应。酸性磷酸酶能充分发挥水解大分子磷酸盐颗粒及降解丛枝中其它物质的作用,从而通过丛枝一宿主质膜界面供给宿主磷分、水分等营养物质。     

腐殖酸对土霉素和土壤酶活性交互响应研究

腐殖酸是一种具有多种官能团，能够与土壤中微量元素络合，增强土壤团粒结构，促进植物根系生长发育，提高作物对营养元素的吸收，改良土壤好氧细菌活性的有机化合物质。课题通过试验研究，探索腐殖酸在改良受土霉素污染的土壤方面的生物学作用，模拟自然环境下土霉素对土壤环境的污染，土壤中各类活性酶的状况，如脲酶、磷酸酶、过氧化氢酶等的生物活性，深入挖掘腐殖酸在土壤修复及农业生产中的重要作用，为农业生产及区域经济发展提供理论支撑。     

‘金冠’苹果PP2C基因克隆及低温胁迫下的表达

【目的】为了鉴定并探究苹果MdPP2C基因对低温胁迫的响应机制。【方法】利用基因克隆技术，从苹果‘金冠’cDNA中克隆得到3个苹果MdPP2C基因，利用生物信息学技术对3个基因的理化性质、系统进化及保守基序等进行分析，并采用real time-qPCR技术检测其在4℃低温处理下的表达情况。【结果】序列分析结果表明，克隆得到的MdHAB1、MdHAI2和MdAHG3分别编码544、405和432个氨基酸，其预测的表观相对分子质量分别为58.26 kDa、44.29 kDa和45.80 kDa,理论等电点分别为5.03、6.63和5.01,均属于酸性蛋白；3个蛋白均属于不稳定蛋白和亲水蛋白，3个蛋白均无跨膜结构，主要定位于细胞核和叶绿体，且3个基因编码的氨基酸序列均具有PP2C超家族保守结构域；real time-qPCR结果表明，低温处理后，MdHAB1、MdHAI2和MdAHG3转录水平均呈现持续上调的趋势。【结论】从‘金冠’中克隆的3个PP2C家族基因均参与苹果‘金冠’对低温胁迫的响应，以上结果为探究苹果PP2C家族基因在苹果属植物对低温胁迫的响应过程及调控机制提供理论基础，为使用分...