实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响

丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫入侵宿主的过程中发挥着关键作用,能够参与到入侵宿主、免疫逃避、炎症反应、凝血系统和细胞迁徙等过程。为了探讨两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Ts Ad SPI和Ts Ka SPI)对巨噬细胞所分泌炎性细胞因子的调节作用,应用实时荧光定量PCR技术对两种SPIs分别处理的小鼠巨噬细胞进行TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、TGF-βmRNA表达水平的检测。结果显示,Ts Ad SPI和Ts Ka SPI均可不同程度的抑制LPS活化的小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12 mRNA的表达水平。并且两种SPI均可不同程度的促进巨噬细胞抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。表明这两种旋毛虫SPI可通过调节宿主巨噬细胞影响入侵时宿主的免疫应答。     

谷胱甘肽硫转移酶参与家蚕氟化物耐受性形成的研究

利用对氟化物高度敏感的家蚕品种733新和高度耐受性品种T6构建耐氟近等基因系,对回交15代的近等基因系群体从幼虫2龄眠起开始至4龄第3天连续添食200 mg/kg Na F溶液浸渍的桑叶,调查蚕体重要代谢酶类谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因表达和酶活性的变化。解剖获取4龄3 d幼虫中肠组织进行双向电泳分析的结果显示,近等基因系群体中耐氟个体中肠的GST表达量比敏感个体明显上调。进一步利用实时荧光定量PCR检测GST基因在耐氟个体与敏感个体中肠、血淋巴、脂肪体和马氏管中的相对表达量,并对5龄1~6 d幼虫中肠、血淋巴中的GST酶活力进行测定。结果表明,家蚕对氟化物的抵抗力可能与体内GST酶活力的强弱有关,由于受氟化物刺激的诱导,可能导致GST基因表达水平发生了变化。研究结果为进一步探索家蚕耐氟机制提供了有用信息。     

乙烯利对干旱胁迫下草地早熟禾生理指标的影响

以草地早熟禾(Poa pratensis)‘Nuglade'品种为试验材料,研究叶片喷施乙烯利对草地早熟禾在水分充足、干旱及复水恢复3种处理下叶片电解质渗透率、叶绿素、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)等生理指标的影响。结果表明,乙烯利与对照组(CK)相比,乙烯利在干旱胁迫下保持更高的叶片相对含水量23.5%(对照为11.5%)和更低的电解质渗透率68.1%(对照为90.7%)及MDA含量53.90μmol·g~(-1)(对照检查131.62μmol·g~(-1)),且复水后的电解质渗透率恢复程度更好;此外乙烯利处理提高了复水恢复过程草地早熟禾的可溶性蛋白含量;说明,叶片喷施乙烯利能够缓解草地早熟禾的干旱胁迫损伤,并促进干旱后的复水恢复。     

玛曲高寒草甸放牧强度的遥感监测

为给玛曲县高寒草甸草-畜平衡和草地资源的可持续利用提供科学依据,本研究利用遥感技术,结合2016年地面实测数据和同时期的MODIS影像资料,分别建立了研究区草地地上生物量和植被指数(NDVI)、相对放牧强度间的回归模型以及不同相对放牧强度和NDVI值之间的幂回归模型。结果表明,6-9月调查点NDVI和地上生物量间存在较好的相关性,即随着NDVI值的增加生物量呈上升趋势,且9月份的拟合(R2=0.510 2)达到了极显著水平;实测地上生物量和相对放牧强度之间有很好的拟合关系(R2=0.965 1),随着放牧强度的增加地上生物量呈下降趋势;相对放牧强度和植被指数间相关性较好(R2=0.631),即随着NDVI值的变小,相对放牧强度逐渐增强,当相对放牧强度增强到一定程度时,NDVI对其响应不灵敏。     

低温胁迫对细茎柱花草与TPRC2001-1柱花草抗寒生理指标的影响

为了探究柱花草的抗寒性,本研究以细茎柱花草(Stylosanthes guianensis var.intermedia)和TPRC2001-1柱花草(S.guianensis‘TPRC2001-1’)营养期叶片为材料,分别进行时长为0(对照)、24h和48h的低温处理,然后对其相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖以及可溶性蛋白的含量等指标进行测定与分析。结果表明,两种柱花草叶片的抗寒性生理指标随着低温处理时间的增加逐步上升。低温处理后,细茎柱花草的相对电导率和丙二醛含量显著低于TPRC2001-1柱花草(P0.05),而脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量显著高于TPRC2001-1柱花草(P0.05)。综合各项生理指标可得,两种柱花草的抗寒性强弱为细茎柱花草TPRC2001-1柱花草。     

紫花苜蓿9个盐响应相关基因表达模式

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上种植面积最大、应用最广泛的豆科牧草。由于其耐盐性中等,其在我国北方地区的产量和种植受到土壤盐渍化的限制。因此提高紫花苜蓿的耐盐性具有重要的科学和生产意义。为此,以龙牧801紫花苜蓿(M.sativa‘Longmu 801’)为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术分析了不同浓度NaCl胁迫下9个盐胁迫蛋白质组筛选出的盐响应相关基因的表达模式。结果显示,处理时间和处理浓度对9个基因的相对表达量均有显著性影响,表明这9个基因均在紫花苜蓿盐胁迫应答中发挥着一定作用。处理1h时,G6PI、ABP19a、Trx-h1、PR bet 1、FBPA、6PGDH和ALDH这7个基因的相对表达量在不同NaCl胁迫浓度处理的紫花苜蓿中均显著上调,RRM和GDPD在NaCl处理2h后开始上调。除G6PI基因,其他8个基因在0.4%NaCl处理下相对表达量显著高于0.2%和0.8%NaCl处理。这些基因参与糖代谢、信号转导和胁迫响应。以上结果表明,紫花苜蓿的耐盐性极其复杂,涉及到多基因的表达和代谢通路的调控。研究结果有助于全面研究并了解紫花苜蓿的盐响应相关基因的表达模式,促进紫花苜蓿耐盐分子育种。     

克隆植物蛇莓相连分株对异质性盐胁迫的可塑性响应

以相同基因型的蛇莓(Duchesnea indica)无性系为材料,选取长势均一的相连分株,以断开状态下分株为对照,对相连分株的姊株进行不同浓度(0、100、200、300mmol·L-1)NaCl的处理,在胁迫第14天时,测定异质盐胁迫下相连两分株的生物量、相对含水量、细胞膜透性和过氧化氢含量变化。结果表明,在连接与断开状态下,随着NaCl浓度的升高与胁迫时间的延长,受胁迫蛇莓姊株生长均受到抑制,相对含水量逐渐下降,细胞膜透性增大,过氧化氢含量上升。但整体上,匍匐茎相连的姊株比断开的姊株受到胁迫程度较轻。在姊株受胁迫的相连分株中,未受到NaCl处理的妹株与对照相比,其生物量、相对含水量与细胞膜透性并未受到显著影响;而妹株叶片中过氧化氢含量随姊株处理浓度的升高而增大。     

嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum),针对GenBank A.phagocytophilum 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16S rRNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立A.phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10~3~6.4×10~8 copies/μL相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A.phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10~2 copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2.0%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A.phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。     

草鱼呼肠孤病毒生长特性研究

以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)873毒株为试验材料,建立了GCRV荧光定量PCR检测方法;用GCRV873株感染CIK细胞及草鱼,通过对病毒RNA复制水平、子代病毒含量以及细胞病变等情况进行监测,研究其在CIK细胞及草鱼体内的生长特性。在CIK细胞中,GCRV感染后12 h即可检测到子代病毒,36 h时,所有细胞被感染;72 h时,病毒滴度达到最高,为10~(6.75) TCID_(50)/mL。在草鱼的肝、脾、肾中,均能检测到GCRV RNA,其中肾脏中含量最高,其次是肝脏,脾脏中最少。本试验为研究GCRV致病机理及制备细胞灭活疫苗奠定了试验基础。