荧光实时定量PCR技术及其在水产养殖研究中的应用

荧光实时定量PCR技术是近年来快速发展起来的一门新技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能较准确定量等特点。本文综述了荧光实时定量PCR技术的基本原理及几种广泛应用的荧光化学方法,并概述了荧光实时定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状,并对荧光实时定量PCR技术的应用前景进行了展望。     

禁食对大口黑鲈生长和肝脏IGF-ⅠmRNA表达丰度的影响

运用实时荧光定量PCR技术,研究禁食对体质量为（100±1）  g 的1龄大口黑鲈（Micropterus salmoides）的生长和肝脏中类胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA表达丰度的影响。在为期6周的实验期间,对照组每天表观饱食投喂2次;禁食组禁食3周后恢复投喂3周。实验期间对照组鱼体质量和体长逐渐增加。6周后,对照组鱼体增重率为10.99%,体长增加率为3.07%。禁食组禁食3周期间,鱼体质量下降了5.08%、体长减少了1.79%。同时肝组织IGF-ⅠmRNA表达水平呈下降趋势,禁食结束时仅为对照组的29.93%。恢复投喂2周后肝组织IGF-ⅠmRNA的表达量仍显著低于对照组（P <  0.05）,鱼体质量为实验初始水平的98.54%,体长为实验初始水平的99.03%;恢复投喂3周后,禁食组鱼体质量、体长恢复到实验初始时水平（P  >  0.05）,但仍与对照组有显著差异（P <  0.01）;肝组织IGF-ⅠmRNA的表达丰度与对照组无显著性差异（P  >  0.05）。结果显示,禁食使大口黑鲈体质量、体长下降,同时肝组织IGF-ⅠmRNA表达丰度也随之降低;而恢复投饲后,其生长、肝脏IGF-ⅠmRNA的表达丰度也逐渐恢复。研究表明,鱼类的营养状况、生长和与IGF-ⅠmRNA的表达之间存有正相关关系。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

无线传感器网络技术在养殖业污染监测上的应用

综述了国际上无线传感器网络技术发展的特点和趋势,提出无线传感器网络技术在畜禽和水产养殖业污染监测上应用需要解决的2个技术问题:一是选择合理的IP无线传输方式;二是选择合理的系统结构,达到较高的性价比。设计出适合不同地域、不同生态环境的无线传感器网络的拓扑结构,实现在户外或野外环境下对畜禽和水产养殖业污染的监测。     

一种池塘养殖溶氧调控系统的研制及应用

为解决池塘高密度养殖存在的缺氧风险问题,设计了池塘溶氧调控系统.根据池塘夜间需氧模型,确定鲤科混养鱼类池塘溶氧安全浓度在3 mg/L以上,增氧时间高于6.2 h/(m2·W·d),增氧时滞为0.2～1.0h.池塘溶氧调控系统由水质在线监测系统、数据信息处理系统、电路控制系统和增氧设备组成,系统对水体溶氧的分辨率为±0.2%,可以有效调控池塘溶氧设备.试验运行发现,池塘溶氧调控系统比传统增氧方式约可节省运行时间33.4%,试验池塘的饲料系数降低了21.6%.系统具有良好的节能、增效效果.     

汽车前照灯智能控制系统的设计

基于汽车驾驶的安全性,结合传感器技术和微控制技术,对汽车前照灯设计了一套智能控制系统。该系统能在不同的情况下,对前照灯的照射角度和亮度进行自动实时调整和自动选择适宜的灯光模式,实现汽车前照灯的智能化控制,提高了汽车驾驶的安全性、舒适性以及智能感觉。     

超声单面平测法在混凝土裂缝检测中的应用

在对超声单面平测法的基本原理进行论述的基础上,分析总结了平测法在混凝土裂缝检测中存在的不足,提出了相应的改进措施。针对深圳水库对香港供水二、三期管道自1983年和1994年分别建成投入使用后,经过多年的运行,供水管道内壁螺仔等附着物增多,个别管段的混凝土结构出现裂缝,对供水管道的安全运行及可靠度可能造成了潜在威胁的情况,本文利用改进后的超声平测法对二、三期供水管道中裂缝的深度进行了探测、分析评判裂缝的发展情况,对二、三期供水管道安全进行评估,复核供水管道结构安全,为管道的安全运行提供了科学依据。     

超声提取-离子色谱法测定芹菜中氯量

研究了超声提取-离子色谱法测定芹菜中氯含量的方法。芹菜经超声提取20 min后,以浓度4.5 mmol/L Na₂CO₃和0.8 mmol/L NaHCO₃为淋洗液,经IonPacAG23分离测定。本方法具有快速、灵敏、准确度高,适合于芹菜中氯量的测定。     

甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择

以甘蔗接种黑穗病菌后0、6、12、24、48、60和72 h时间点的材料为研究对象,应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR Real-time qPCR)技术,探讨25S rRNA、GAPDH、β-actin和β-tubulin4个内参基因mRNA水平的表达情况.经geNorm程序统计学分析,4种内参基因的表达稳定性各异,25S rRNA>GAPDH>β-actin>-tubulin,其中以25S rRNA表达稳定性最好,且根据该基因设计的两对定量PCR引物都是可行的.同时,甘蔗PPO基因表达特性的定量PCR分析也显示,甘蔗PPO基因与植物的抗病性相关.结果显示,研究中所筛选的内参基因是合适的.     

猪δ冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),根据PDCoVM基因保守区域设计引物和探针,建立了一种PDCoV实时荧光RT-PCR检测方法,并评价了该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法的拷贝数对数值与Ct值在1.3×10³～1.3×10⁷ copies/μL拷贝数浓度范围内呈现良好的线性关系,R²=0.994;最低检出限为13 copies/μL,且无非特异性扩增;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.24%～2.15%,均小于3%。利用该方法和普通RT-PCR对42份临床样品同时进行检测,发现本方法比普通RT-PCR灵敏性更高,二者符合率为95.2%。以上结果表明,本试验建立的实时荧光RT-PCR方法灵敏、特异、可靠,可用于PDCoV的临床检测和流行病学调查。