急性热应激对山羊血液生化指标及血淋巴细胞热休克蛋白70家族基因表达的影响

旨在研究急性热应激对山羊抗氧化能力、免疫功能和血淋巴细胞热休克蛋白70(HSP70)家族基因表达的影响。本试验选取5只健康、体况接近的(12±0.5)月龄波尔山羊×关中奶山羊杂交F1母羊,饲养于环控舱内(温度维持20℃,相对湿度60%),适应5d。第6天利用环控舱对5只试验羊进行38℃急性热应激处理12h,采集热应激前(0h,20℃)和热应激后2、4、8和12h试验羊血样。分别利用比色法测定血清抗氧化指标(总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛含量),ELISA法测定血清免疫指标(免疫球蛋白和细胞因子含量),实时荧光定量PCR法测定血淋巴细胞HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)mRNA的表达量。结果显示:1)热应激时间对血清抗氧化指标有显著影响。与热应激前0h相比,血清T-AOC(P<0.05)、SOD(P<0.05)和GSH-Px(P<0.01)活性均在热应激8h后显著下降,MDA含量在热应激4h后显著增加(P<0.05)。2)热应激时间对血清免疫指标有显著影响。与热应激前0h相比,血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IL-2含量分别在热应激4、8、8和4h后显著增加(P<0.05);IL-4(P<0.01)、IgG(P<0.01)、IgM(P<0.01)和IgA(P<0.05)含量分别在热应激12、4、4和4h后显著下降。3)热应激时间显著提高血淋巴细胞中HSP70家族基因(HSPA1A、HSPA6和HSPA8)的表达量。HSPA1AmRNA表达量呈先升高后下降的趋势,在热应激4h时达到峰值,各检测时间点均显著高于应激前水平(P<0.01);HSPA6mRNA表达量在热应激2h时显著升高(P<0.01),4h后恢复到应激前水平(P>0.05);HSPA8mRNA表达量在热应激4(P<0.05)、8(P<0.01)、12h(P<0.01)时显著高于应激前水平。在本试验条件下,38℃急性热应激能够抑制山羊的免疫和抗氧化功能;提高血淋巴细胞HSPA1A、HSPA6和HSPA8基因的表达量,其中HSPA1A对热应激温度和时间更敏感,可作为山羊热应激早期的分子标志物。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

施氏鲟精子诱导匙吻鲟雌核发育

采用照射强度为10 188 μW/(cm2·s),照射距离为15 cm的紫外线对施氏鲟(Acipenser schrenckii)精子进行4～7 min的照射,用照射后的精子对匙吻鲟(Polyodon spathula)卵进行人工授精,以探索精子的最佳紫外线照射时间.设计热休克起始时间、持续时间和休克温度3因子、3水平的正交试验,以探索人工诱导匙吻鲟雌核发育的理想热休克条件.结果表明:用紫外线照射5 min处理的施氏鲟精子,与匙吻鲟卵受精所得胚胎经染色体观察均为单倍体(n=60),表明照射精子遗传失活的有效性和可靠性;若热休克处理前受精卵保持在(18±013)℃,在一定的休克温度(35～39℃)条件下,于不同时间(受精后16～20 min)起始热休克,持续处理2 min均能诱导受精卵染色体加倍.对热休克处理条件的优化结果表明,将受精卵于受精后18 min,在37℃的水中热休克处理2 min,二倍体诱导率最高,达18.8%.染色体鉴定显示,该条件下处理的胚胎均为二倍体(2n=120),未发现单倍体和非整倍体.本研究为进一步分析异源精子诱导匙吻鲟雌核发育机制以及匙吻鲟性别决定的分子机制奠定了基础.     

渔药生产企业发展艰难软筋何在

我国至2004年专业生产渔药的企业达150家,附带生产渔药的兽药企业达250多家,近年来随着国家兽药GMP的不断认证,同行企业数量进一步增加,企业之间的竞争趋于白热化,有的企业静止等待面临倒闭,有的企业连出举措但依然步履艰难。到目前为至,年销售额小于三千万的渔药企业要占70％以上,部分企业处于休克状态,纠其原因,软筋何在？     

热休克诱导黄颡鱼三倍体的研究

以正交试验设计,采用热休克法研究了诱导三倍体黄颡鱼的适宜条件.试验结果表明,在卵受精后2 min,40 ℃持续处理2 min,三倍化率可达57.5%,原肠期相对存活率43.0%,孵化期相对存活率38.5%.分析了热休克处理的参数与三倍体出现率和胚胎相对存活率的关系,诱导参数中处理温度和诱导时机为重要因素,其次为持续时间.     

仔猪早期断奶应激综合症防治

<正>早期断奶的仔猪,因诸多方面应激因素和机体内环境的不适应往往会导致断奶后的1～2d内仔猪出现腹泻或水肿,少数为内毒素休克,常被称为早期断奶仔猪应激综合症。早期断奶仔猪应激导致仔猪发病死亡或生长停     

低盐胁迫下松江鲈HSPB1、HSPB7和HSPB11基因的表达变化规律

为了探究小分子热休克蛋白基因HSPB1、HSPB7和HSPB11在松江鲈(Trachidermus fasciatus)应对低盐胁迫过程中的调节作用,本研究基于前期转录组数据,获取3个目标基因的序列信息并进行了系统进化分析,利用实时荧光定量PCR技术检测了3个基因在两种低盐胁迫处理下不同时间点(0 h、12 h、24 h和48 h)在鳃、肠、肾和肝组织中的表达水平。系统进化分析结果表明, HSPB1、HSPB7和HSPB11基因分别聚类形成独立分支;在各基因分支中,松江鲈与已报道的鲈形目、鲤形目和鳉形目等鱼种共同聚为硬骨鱼类分支。在两种低盐胁迫处理下, 3个基因在鳃组织中的表达量均在12h显著升高,而在肠、肾和肝组织中的表达量则呈现不同的变化趋势。肠组织中,HSPB7和HSPB11在盐度渐变低盐胁迫(盐度变化速率1.1/h)下表达量均显著升高, HSPB1表达量在48 h显著降低;盐度骤变低盐胁迫(盐度变化速率27/h)下HSPB1和HSPB7表达量在24 h显著升高, HSPB11表达量显著降低。肾组织中,HSPB1、HSPB7和HSPB11表达量均仅在盐度渐变低盐胁迫24h显著升高;盐度骤变低盐胁迫下HSPB1表达量显著降低, HSPB7和HSPB11表达量则显著升高。肝组织中, HSPB7无表达; HSPB1表达量在盐度渐变低盐胁迫下无显著变化,但在盐度骤变低盐胁迫下则显著升高;HSPB11表达量在两种处理下均显著升高。本研究比较分析了HSPB1、HSPB7和HSPB11基因在松江鲈应对不同低盐胁迫时表达变化规律的异同,相关结果为探讨小分子热休克蛋白在鱼类应激调节过程中的作用及洄游性鱼类适应盐度变化的分子调控机制提供了理论依据。     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

热休克诱导马苏大麻哈鱼三倍体的初步研究

为探索马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)三倍体育种技术方法,更好地解决其个体小、生长慢和性成熟后死亡率高等问题,采用热休克法进行三倍体诱导实验,设4个诱导温度(24、26、28、30℃),2个起始诱导时间(15 min、20 min)和2个持续诱导时间(15 min、20 min)共分13个实验组和1个对照组。结果显示,13个实验组均能诱导出三倍体个体,而不同温度组的诱导率差异显著,分别为13.3%、31.65%、52.28%和78.81%(P<0.0.5)。随着温度的上升,孵化率呈显著降低的趋势。结果表明,温度是影响诱导成功的关键因素,利用热休克诱导受精卵制备陆封型马苏大麻哈鱼三倍体苗种的方法是可行的,三倍体诱导的最佳条件是:水温28℃,卵子受精后15 min持续处理20 min,发眼率(72.57±0.26)%,孵化率(60.92±0.31)%,三倍体率53.1%,综合诱导效果最佳。     

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。