胚胎干细胞途径的基因打靶技术

简要介绍了转基因技术、基因打靶以及胚胎干细胞的性质特点,详细阐述了胚胎干细胞途径的基因打靶技术的原理、方法及应用。胚胎干细胞途径的基因打靶包括以下几个步骤:选择合适的ES细胞系、构建外源DNA片段打靶载体、目的基因筛选、ES细胞的转化、ES细胞的药物筛选、抗性克隆的分离与扩增、PCR与SOUTHERN印记、基因打靶小鼠的获得-嵌合体制作。以期为胚胎干细胞和基因打靶技术的进一步研究提供方法。     

体细胞多位点基因打靶技术的研究

利用多拷贝序列作为靶位点进行多位基因打靶技术的研究，通过显微切割，菌落杂交，Southern杂交等方法获得人类D、G组染色体短臂多拷贝序列（DGMS），然后利用DGMS的构建含Neo/TK基因正负选择系统的基因打靶载体，采用电穿孔，G418和GCV筛选进行Neo基因的基因打靶，并经PCR、FISH定位，Neo基因表达等证实Neo基因定点整合到D、G组染色体短臂且表达，最终建立了一种有效的，多个安全位点的基因打靶技术，该技术可应于体外细胞和动动植物的转基因，甚至人类的基因治疗。     

用丝心蛋白轻链基因构建转基因家蚕基因打靶载体

家蚕（Bombyx mori)的丝心蛋白启动子是自然界中最强的启动子之一，若能使外源基因在丝心蛋白启动子控制下得到重要的意义。研究从天蛹中提取家蚕基因组DNA，用PCR的方法克隆了丝心蛋白轻链基因的5kb和0.5kb两个片段。DNA序列分析表明，不同蚕品种2－7外显子范围内DNA序列源性达95．7％。用PCR的方法在GFP基因前端加上凝血酶的识别序列，并克隆到轻链基因的5kb和0.5kb两个片段中间，使GFP基因具有正确的读码框，能和轻链蛋白融合表达。将这一融合的DNA大片段克隆到pBacPAK8转移载体上，构建成一种新型的转基因家蚕打靶载体pBacFL53TG，用于家蚕丝腺生物反应器的研究。     

多位点基因打靶的定点整合效率研究

利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术.