植物细胞质雄性不育恢复基因的克隆研究进展

细胞质雄性不育的恢复涉及线粒体基因组中的不育基因与核编码的育性恢复基因的相互作用,而恢复基因与CMS相关基因相互作用机理的最终阐明,有赖于Rf基因的分离与克隆.本文综述了目前已克隆的植物Rf基因,这些基因主要包括玉米的Rf 2基因、矮牵牛的Rf基因、萝卜的Rfo和Rfk 1基因以及水稻的Rf-1基因等.     

水蛭素的全基因合成及克隆

报道了水蛭素全基因的合成及克隆。根据已知水蛭素氨基酸序列及酵母菌体内蛋白质表达特性,设计了水蛭素的全基因序列,采用化学合成及酶学相结合的方法,合成了该基因片段,并逐段克隆至载体ｐＢＳ上,得到全长水蛭素基因。序列测定表明,克隆后ＤＮＡ顺序同原设计序列。     

基因表达文库的构建及其方法分析

基因表达文库构建和筛选技术是80年代初发展起来的用于筛选和克隆基因的基本手段。表达文库中含有大量基因表达信息，使其成为广大实验室优先建立的文库之一。迄今为止，表达文库的构建方法在传统方法的基础上不断被改善，针对各种类型的目的基因克隆的要求，可以选择不同的载体和方法来构建适当的基因表达文库。本文详细介绍了多种构建基因表达文库的方法，比较它们的构建方法的优点和不足之处，并对它们在实际应用中的作用作了较为全面的分析。     

分子生物学技术在甘薯中的应用

甘薯是重要的粮食作物,它的遗传背景复杂,分子生物学研究进展落后于水稻、玉米等作物。分子标记技术主要应用于甘薯的遗传图谱构建、遗传多样性分析以及亲缘关系分析等方面。目前,已经构建了数张遗传图谱,亲缘关系分析表明三浅裂野牵牛I.trifida与甘薯有很紧密的亲缘性。基因克隆技术已经应用于甘薯在抗逆、品质以及块根发育等相关基因的分离,为甘薯的分子育种带来了有益的目的基因。在栗子香、新大紫等甘薯品种有转基因的报道,采用农杆菌介导的方法,已经取得了少量的转基因植株。     

小麦小G蛋白Tarab5B基因全长cDNA克隆及表达特性的初步分析

通过对白粉病菌诱导的小麦叶片cDNA文库的测序,获得1个与水稻Rab5B基因一致性达89%的序列.以该序列为信息探针,筛选小麦EST数据库并进行电子拼接.根据拼接结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了1个小麦中尚未鉴定的全长cDNA克隆Tarab5B.Tarab5B基因编码的蛋白具有结合GTP/GDP的4个保守结构域以及Rab家族成员所特有的结构域.同源分析表明,该基因属于Rab5B亚族.麦类Rab5B蛋白的GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA和MGCSSS 5个结构域在进化上非常保守,而YYRGA结构域及其邻近的C端6个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低.RT-PCR检测显示,抗、感两个材料Tarab5B基因在接种后24 h和未接种24 h的表达水平基本相同;在接种后1 h、4 h、7 h、12 h,抗、感两个材料间Tarab5B基因的表达水平有一定差异.     

大豆孢囊线虫与寄主植物的相互关系及抗性基因克隆策略

本文概述了大豆孢囊线虫与寄主植物相互作用过程中病原与寄主的相互识别，寄主植物的防御反应的分子机理，提出了克隆大豆孢囊线虫抗性基因的分子策略。     

猪流感病毒（A／swine／Jiangsu／2／2006（H3N2）NS1基因表达产物分析

采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。     

东方山羊豆脱水蛋白基因的克隆及初步分析

 采用ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ 方法,从东方山羊豆盐诱导抑制性差减杂交ｃＤＮＡ 文库中分离到了一个脱水蛋白（GoDHN）基因。该基因ｃＤＮＡ 全长１１６９ｂｐ,开放阅读框８４３ｂｐ,编码２８１ 个氨基酸,编码的蛋白质分子量为２８．７１ｋＤａ。经实时荧光定量ＰＣＲ 分析,GoDHN 基因在东方山羊豆的茎和叶中表达量明显高于根中表达量,并且基因表达受ＡＢＡ、ＮａＣｌ和ＰＥＧ 的诱导,随着诱导时间的增加,表达量呈持续增长趋势。这些结果表明,DHN 基因在东方山羊豆的抗逆性中可能起到重要的调控作用。本研究成功构建了ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２-ＤＨＮ 植物表达载体,为下一步转基因研究奠定了基础。     

甜菜抗草甘膦除草剂基因的克隆

常规甜菜对除草剂表现为高度敏感。为了获得抗草甘膦除草剂转基因甜菜材料,通过RT-PCR技术,对草甘膦靶基因AtEPSPs（GenBank No.NM_202267.1）的功能域进行克隆。将扩增后的片段连接到测序载体pMD 18-T,进行酶切和测序鉴定。结果表明,AtEPSPs基因的核苷酸长度为1470 bp,推断编码490个氨基酸,确认获得了抗草甘膦除草剂基因功能片段。     

Cloning and Sequence Analysis of New α-Gliadin Genes from Triticum monococcum

α-醇溶蛋白是人们生活中消费最多的蛋白,由于含有引起乳糜泻（CD）的主要毒性肽成分,也是引起CD的最活跃的蛋白。为了解一粒小麦在小麦品质育种中的潜力,利用1对α-醇溶蛋白的特异引物,采用基因组PCR法从栽培一粒小麦中克隆α-醇溶蛋白新基因,共获得片段大小为856～882bp的4个基因序列,分别命名为AA-6、AA-8、AA-9和AA-21（GenBank登录号为JN831382～JN831385）。其中,AA-8、AA-9和AA-21均在102位因C→T替换而导致TAG终止子出现成为假基因;AA-6由882个核苷酸构成,可编码293个氨基酸,与已知基因的最高同源性为99%,推断氨基酸序列具有α-醇溶蛋白的典型结构,是α-醇溶蛋白家族的新成员。AA-6的CD毒性肽分析表明,除不含A基因组所没有的glia-α和glia-α2毒性肽外,其他已知的7种毒性肽均有分布。AA-6和86个来源于小麦及其祖先供体种的α-醇溶蛋白的同源性分析表明,α-醇溶蛋白基因存在基因组来源的差异性,其中,A、D基因组来源的α-醇溶蛋白基因的相似性较高。