山麻鸭SCA-2基因克隆、生物信息学及组织表达谱分析

为了探究Struthiocalcin-2(SCA-2)基因在山麻鸭蛋壳形成过程中的作用,试验选择9只产蛋高峰期(30周龄)的健康山麻鸭,采用SMART-RACE方法对山麻鸭SCA-2基因cDNA序列进行克隆,运用生物信息学软件对SCA-2基因编码蛋白质的理化性质、二级和三级结构进行预测及分析,构建SCA-2基因系统进化树;采集试验山麻鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌、肌胃、下丘脑、垂体、卵巢,以及输卵管的漏斗部、膨大部、峡部和子宫部共14个组织,每3只做一次混样处理,每个组织共3个重复,提取组织RNA,通过实时荧光定量PCR分析SCA-2基因mRNA在上述组织中的相对表达量。结果表明：SCA-2基因的cDNA全长为726 bp,该基因编码蛋白的分子式为C₈₃₆H₁₂₄₇N₂₂₉O₂₄₇S₈,属于不稳定蛋白,其中丝氨酸(12.6%)、亮氨酸(12.0%)、丙氨酸(10.2%)含量较高;蛋白质的二级结构中,α螺旋占23.35%、β折叠占13.77%、无规卷曲占62.87%,且包...     

中国辣椒BCAT基因家族鉴定、表达分析及克隆

【目的】了解中国辣椒（Capsicum chinense Jacq.）BCAT基因家族成员的分布、性质及表达模式。中国辣椒是辣椒的5个主要栽培种之一,果实通常具有由支链酯类形成的浓郁果香。支链氨基酸转氨酶（BCAT,Branched-chain Aminotransferase）负责催化支链氨基酸合成相应2-氧代酸,是催化合成支链酯类的第一步反应酶。【方法】使用生物信息学分析和实时荧光定量PCR等方法对中国辣椒的BCAT基因家族成员进行鉴定、表达分析和克隆。【结果】获得5个BCAT基因家族成员,分别命名为CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3、CcBCAT4和CcBCAT5,随后对其进行生物信息学分析并克隆CcBCAT1～CcBCAT4。生物信息学分析显示,这些基因分布于辣椒的4条染色体上,蛋白均为亲水性蛋白,氨基酸长度在184～557 aa,分子量为20.29～89.60 ku,等电点为5.57～8.34。亚细胞定位预测结果显示,CcBCAT1定位于叶绿体和线粒体,其他基因家族成员均位于叶绿体。CcBCATs基因时空表达分析显示,CcBCAT1-4基因具有组织表达特异性,Cc...     

团头鲂(Megahbrama amblycephala) Caspase 9 基因全长cDNA的克隆及在氨氮胁迫下的表达分析

为了解团头鲂(Megahbrama amblycephala) Caspase 9基因序列特征及其在氨氮胁迫过程中的作用,应用末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到团头鲂Caspase 9基因全长1613 bp的cDNA序列,包括185 bp的5 '末端非翻译区(Untranslated regions,UTR)、96 bp的3'UTR、1332 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF).氨基酸多序列比对显示,平均同源性为77.74％,表明团头鲂Caspase9基因具有较高的保守性;系统进化分析显示,该基因氨基酸序列与其他鱼类Caspase 9聚为一支,并与锦鲤(Cyprinus carpio) Caspase 9亲缘关系较近;荧光定量PCR结果显示,Caspase 9基因在团头鲂各组织中均有表达,在脑中表达量最高,在肌肉中表达量最低,同时,在胁迫和恢复过程中,该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫期间出现表达量上调,整体呈类似波浪形表达谱.研究结果表明,氨氮胁迫下,Caspase 9基因参与团头鲂的免疫防御,并与细胞凋亡分子过程有关.本研究结果可为进一步了解团头鲂应答氨氮胁迫分子机制提供理论依据.     

中华绒螯蟹FAD6-b基因的全长克隆及原核表达分析

根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ6去饱和酶基因(Accession Number:JX946434)及菁夜蛾去饱和酶基因(Accession Number:KJ622055.1)的保守区设计引物,通过逆转录PCR以及RACE技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ6去饱和酶基因FAD6-b的全长序列。经序列分析,中华绒螯蟹FAD6-b cDNA全长为2 310 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 326 bp,共编码442个氨基酸(Accession Number:KP876058),理论分子量为50.86 ku,理论等电点为8.47,FAD6-b基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ6去饱和酶基因的一致性为76%。原核表达载体构建及其表达实验表明,中华绒螯蟹FAD6-b基因成功重组到原核表达载体pCold-TF DNA中,重组质粒pCold TF-fad6b在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,经SDS-PAGE电泳分析表明,IPTG诱导后的重组菌出现了单一的蛋白条带,且大小与预期(105.86 ku)一致,可溶性分析显示目的蛋白主要存在于蛋白上清液中。对重组蛋白进行纯化,蛋白纯化液经电泳检测后显示出特异性单一条带,进一步证明了pCold TF-fad6b的成功构建和表达。目的蛋白经Western-blotting检测,结果表明获得的重组蛋白与6×His抗体进行了特异性结合,显示出良好的免疫学活性。     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。     

低频声波频率下瘤背石磺CaM-like、CaMKII基因的表达及功能

长期栖息于潮间带的动物能够感知当地的潮汐规律,形成潮汐记忆的能力。本研究以栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)为对象,研究其通过感知潮汐来临时产生的低频声音来调节其行为与潮汐节律相协调的分子机制。通过RACE-PCR技术克隆到CaM-like基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaM-like基因的cDNA全长2321 bp,包括5′非编码区(UTR)366 bp,3′非编码区(UTR)1337 bp,618 bp的开放阅读框编码206个氨基酸;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3165,分子量约为23029.64 kD,理论等电点4.64,分子式是C_(1018)H_(1544)N_(274)O_(320)S_9。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺CaM-like基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CaM-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学分类相吻合。在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,应用qRT-PCR检测CaM-like基因在不同组织的分布情况,结果显示CaM-like mRNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于背部皮肤、腹足、肠、肝胰腺、口器和蛋白腺等组织(P0.05),推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示CaM-like、CaMKII基因分别在25 Hz和50 Hz低频声波下刺激12.4 h表达量较高,初步推测其能感知25～50 Hz声波频率。这可能与栖息于潮间带中的瘤背石磺长期感知12.4 h半日潮潮汐周期节律,形成潮汐记忆有关。本研究将为进一步深入了解瘤背石磺感知潮汐节律的分子机制奠定基础,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供依据。     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

镜鲤△6脂肪酸脱氢酶CDNA的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到镜鲤Cyprinus carpio肝脏中高不饱和脂肪酸(HUFA)合成代谢的脂肪酸去饱和酶(△6FAD)基因c DNA全序列。结果表明:镜鲤△6FAD基因c DNA全长为1 446bp,开放阅读框(ORF)为1 332bp,编码444个氨基酸。编码的蛋白序列包含FAD全部特征结构区,包括1个细胞色素b5结构域、2个跨膜区和3个组氨酸簇,与其他鱼类的Δ6FAD氨基酸序列具有69.0%~92.0%的同源性。系统树分析显示:与斑马鱼Danio rerio的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测发现:脂肪酸延长酶基因在镜鲤肝脏中表达量最高,背部肌次之,在血液中表达最低。本研究结果为进一步研究镜鲤HUFA的合成途径及调控机理提供了基础资料。     

暗纹东方鲀mtDNA的分离纯化及其细胞素b基因的分子克隆

利用改进的差速离心法和碱裂解法制备并分离纯化了暗纹东方纯mtDNA,测得分子大小为19．4Kb。用线粒体特异染色法跟踪和监测线粒体提取,结果表明,25000-35000g能获得90％以上的高得率。利用制备纯化的mtDNA,已首次克隆了暗纹东方纯细胞色素b基因(cytb)。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因疫苗pEGISI,将pcISI中的乙肝表面抗原（HBsAg）S基因及插入S基因中的抑制素（INH）基因片段酶切回收;PCR扩增pcISI中INH基因片段,调整阅读框,一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5’端,构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞,16h后检测到绿色荧光,48h检测到强烈荧光,说明融合基因在293T细胞获得高表达;ELISA检测证实,表达产物ISI—EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。