盐胁迫下拟南芥SCAMP基因克隆和表达的生物信息学分析

为探究分泌载体膜蛋白（Secretory carrier membrane protein, SCAMP）的功能,采用PCR方法从模式植物拟南芥中克隆到5个SCAMP基因,进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术分析5个SCAMP基因在盐胁迫下的表达模式。结果显示,拟南芥SCAMP蛋白的相对分子量为30.1~33.2 kDa,等电点为6.60~9.18,属于不稳定性疏水蛋白,二级蛋白结构中主要包含4种构象:α–螺旋（Alpha helix, Hh）、无规则卷曲（Randon coil, Cc）、直链延伸（Extended strand,Ee）和β–折叠（Beta turn,Tt）,其中以α–螺旋为主,包含4个跨膜结构域,N端和C端均在细胞膜内。实时荧光定量PCR结果表明,AtSCAMPs的表达量均受盐胁迫诱导上调表达,AtSCAMP1,AtSCAMP3,AtSCAMP4,AtSCAMP5基因在叶中的表达明显高于根,且AtSCAMP4和AtSCAMP5在叶中受盐胁迫变化最明显。     

花生中FAR1-5转录因子的克隆和功能分析

FARl是一类起源于转座子酶的转录因子,在光敏色素A(phyA)信号通路启动、植物光形态建成中具有重要作用。本试验对抗旱花生品种J11的FAR1-5基因进行了克隆,通过序列比对进化分析,表明其与野生花生Arachis duranensis,A.ipaensis相关基因具有较高相似度。干旱胁迫状态下,转基因植株抗旱性强于野生型植株,抗氧化酶活性增强,表明该转录因子可积极响应花生抗旱胁迫。研究结果可为花生抗旱育种提供新的基因资源。     

芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’（Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’）通用调节因子14-3-3基因cDNA序列,命名为Br14-3-3（GenBank登录号为MK896872）。该基因全长1 113 bp,开放阅读框全长774 bp,编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达,结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高,幼苗中次之;低温抑制了Br14-3-3的表达,其他非生物胁迫可诱导该基因表达,暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

滇水金凤CHI基因的克隆及表达分析

【目的】查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是花青素合成途径中的关键酶之一。通过克隆滇水金凤(Impatiens uliginosa) CHI基因并对其进行表达分析,进而探究滇水金凤花色形成及变异机理,为凤仙花花色改良及新品种培育奠定了一定的基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术进行基因克隆,利用DNAMAN和MEGA-X软件对所克隆基因的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,利用qRT-PCR分析CHI基因的表达模式。【结果】克隆得到滇水金凤CHI基因的2个片段,命名为IuCHI1和IuCHI2,其cDNA全长序列分别为741 bp和636 bp。同源性分析表明,滇水金凤CHI基因的氨基酸序列与茶(ASU87415.1)、橄榄(AEO36936.1)等12个物种的序列同源性达到55.99%。系统进化分析表明,滇水金凤CHI1和CHI2均单独成一枝。表达分析表明,在红色滇水金凤中,2个CHI基因在4个花发育时期的表达量均呈逐渐上升趋势,而在白色滇水金凤中的表达量在第3时期最高,在其它几个时期则相对较少。【结论】推测滇水金凤的2个CHI基因为旁系亲缘关系,其在白色花和红色花的4个花发育时期的表达模式显示出一致性。     

雨生红球藻植物类型隐花色素基因克隆与序列分析

为了从雨生红球藻中获得感知蓝光信号的植物类型隐花色素(CRY)序列,采用同源克隆和RACE相结合的方法获得了雨生红球藻编码植物类型Hae-P-CRY的c DNA全长,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,Hae-P-CRY基因的c DNA全长为3 608 bp,包含开放阅读框全长2 988 bp,编码995个氨基酸,预测等电点6.19,理论分子质量为107.7 ku。经Blast P分析发现,Hae-P-CRY氨基酸序列与莱茵衣藻来源植物类型Cre CRY氨基酸序列的相似性达到66.6%,与拟南芥CRY氨基酸序列相似性为46.94%。系统进化分析表明,Hae-P-CRY与其他真核绿藻来源的植物型CRY聚在一支,属于植物类型CRY。结构域分析表明,Hae-P-CRY基因含有光感知PHR结构域和信号转导CCT结构域,暗示具有感知和转导光信号功能。试验从雨生红球藻得到植物类型Hae-P-CRY基因序列,可为其表达、功能及互作蛋白研究奠定基础,同时为进一步解析雨生红球藻在蓝光响应中的分子机制奠定基础。     

绵羊角细胞关联蛋白2基因克隆与表达分析

为克隆绵羊角细胞关联蛋白2(Keratinocyte-associated protein 2, KRTCAP2)基因mRNA并分析该基因表达分布规律,本研究首先提取小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤及不同组织总RNA,RT-PCR方法克隆KCTCAP2基因并进行两个品种间的比较分析,随后利用HRM方法对目的 SNP位点进行基因多态性分析,最后用q RT-PCR方法分析两个品种不同组织间KRTCAP2基因的时空表达分布。RT-PCR扩增显示绵羊皮肤组织出现略小于500 bp的特异性条带,测序证实该片段为KRTCAP2基因,长度为466 bp,编码149个氨基酸。所克隆的4条片段中存在4个SNP位点,其中2个SNP位点引起氨基酸位点突变。针对c.194位A>G突变位点设计的HRM检测发现小尾寒羊、新吉细毛羊等群体中并不存在该多态位点。小尾寒羊与新吉细毛羊不同组织间的表达分布显示,KRTCAP2基因存在多组织表达特性,在两品种羊组织表达模式既存在一致性也存在差异性。一致性主要表现为小尾寒羊与新吉细毛羊中肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道与皮肤组织中KRTCP2表达量较心脏组织呈现上调表达的趋势。差异性表现为新吉细毛羊在肝脏、脾脏、肺脏、肠道、脑和皮肤的组织表达量均高于小尾寒羊,在肌肉和卵巢组织中的表达量低于小尾寒羊,在肾脏组织中的表达量基本持平。本研究成功克隆出绵羊KRTCAP2基因并进行了系统分析,为探讨绵羊角细胞功能奠定了基础。     

玉米轴色突变体698-3R的遗传鉴定

以辐射诱变获得的玉米红轴突变体698-3R为材料,通过遗传交配设计分析轴色的遗传规律,利用SSR-BSA法初步定位轴色基因,并对候选基因进行克隆和表达分析。结果表明:(1)突变体698-3R的红轴对白轴性状表现为显性遗传,受一对核基因控制,初步定位在第一染色体上的SSR标记phi095与umc1452之间,与phi095相距3.9cM,与umc1452相距7.1cM,将该基因暂定名为C(t);(2)以轴色基因 P1的cDNA为模板克隆C(t),发现698-3R有3个C(t)转录本,而野生型698-3中至少有2个;预测氨基酸序列比对发现,698-3R中3个C(t)蛋白的氨基酸序列与已知P_1-wr蛋白一致,突变使其获得完整的MYB结构域和酸性激活域,而野生型698-3中698-3-P-1蛋白由于编码序列缺失导致移码突变,不具有该功能结构域;(3)对C(t)基因qRT-PCR分析发现,除25DAP外,其余4个时期在698-3R中表达水平均显著或极显著高于698-3;以 A1和 C2基因表达验证分析发现,C(t)与验证基因表达模式一致,说明C(t)可能具有 P1激活调控 A1和 C2基因表达的功能。推测该红轴基因C(t)可能为一个 P_1-wr基因。     

九香虫溶菌酶CcLys2的基因克隆与生物信息学分析

九香虫Coridius chinensis是一种药食两用的资源昆虫,溶菌酶是一种能水解细菌中黏多糖的胞壁质酶。本研究克隆了一种九香虫溶菌酶基因CcLys2,其cDNA长1096 bp,包含一个长672 bp的开放阅读框,编码223个氨基酸(aa)。九香虫溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa组成的信号肽,成熟CcLys2是一种分子量为23.34 kDa的分泌型亲水蛋白。成熟CcLys2形成7个α-螺旋和2个β-折叠片的三维分子结构,并由4个二硫键稳定其构象。同源性和聚类分析表明,CcLys2与来自斯氏珀蝽Plautia stali的C-型溶菌酶的亲缘关系最近。生物信息学分析结显示,CcLys2很可能属于具有消化作用的C-型溶菌酶。本研究为今后进一步阐明CcLys2基因的功能及开发新型抗菌药物奠定基础。