肝癌细胞靶向肽的筛选与鉴定

利用噬菌体环七肽库筛选与肝癌细胞特异性结合的多肽,并对其亲和力进行生物学鉴定。以HL-7702为消减细胞,HepG2为筛选靶细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮全细胞消减筛选,并随机挑取60个阳性噬菌体克隆,以ELISA法鉴定其与HepG2细胞的结合活性,并取阳性克隆进行测序分析,并合成多肽进行免疫细胞化学染色鉴定。经4轮筛选,噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集;利用ELISA从随机挑选的60个噬菌体克隆中得到15个与肝癌细胞具有高结合力的阳性克隆,测序并进行序列分析比对发现氨基酸序列无同源性,经免疫细胞化学染色鉴定后,发现1条多肽序列亲和力较高,为提高抗菌肽对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础。     

浅谈噬菌体的临床应用

正噬菌体又称细菌病毒,它可以侵入细菌细胞中,通过酶的作用,破坏细胞壁,使细菌裂解,进而杀死细菌。噬菌体分为烈性噬菌体及温和性噬菌体,前者可在敏感宿菌内增殖,并使之裂解,亦称为毒性噬菌体。后者侵入敏感的宿主细胞后,会引起宿主裂解,它以前噬菌体的形式整合在宿主的基因组上,随后者的复制而进     

T4噬菌体蛋白的分子改造及其应用前景

T4噬菌体是一种病毒,其基因、结构和生物学特性已清晰,利用各种分子操作技术可以对其进行进一步改造。利用位点特异性诱变,研究T4噬菌体某些基本蛋白的功能;普遍用来进行噬菌体改造的噬菌体展示技术已经成功在T4衣壳平台上展示目的抗原;位点特异性诱变及噬菌体展示技术都可以用于改造噬菌体使其与哺乳动物细胞发生相互作用,也能获得除细菌宿主之外的可被噬菌体感染的细胞;还可在不断发展的噬菌体治疗研究中得到应用。这些噬菌体的改造方法都将会促进疫苗技术、噬菌体疗法和其他生物及医学科学分支的发展。论文对T4噬菌体的蛋白结构、噬菌体展示技术及相关的噬菌体治疗等内容进行了综述。     

噬菌体肽库技术筛选抗PRRSV肽及其应用

噬菌体展示肽库是一种被广泛用于抗原表位鉴定,结合蛋白筛选的技术。该试验利用噬菌体展示技术筛选与猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）ORF1B复制酶蛋白相互作用的蛋白,并进一步验证筛选蛋白的抗病毒作用。以表达纯化的PRRSV ORF1B蛋白CTD包被高亲和性96孔板作为靶蛋白,应用T7噬菌体展示技术对随机12肽库cDNA文库进行筛选,并分析测序筛选的克隆。将筛选出的克隆序列合成后,在体外验证合成多肽的抗PRRSV效果。结果表明,在4轮的噬菌体筛选后,共得到87个阳性克隆,经测序鉴定出11个筛选的12肽,并通过体外抗病毒试验得到P10是一个具有高抗病毒活性的12肽。试验结果为PRRSV的抗病毒研究奠定了基础。     

噬菌体RAP44感染鸭疫里默氏菌的电镜观察

为了解噬菌体RAP44对鸭疫里默氏菌的侵染及裂解过程,本研究应用透射电镜进行观察。结果显示,噬菌体RAP44头部外廓呈六边形,平均直径约60nm,尾长约210nm,尾宽约8nm。RAP44与宿主菌混合后,5min内即能通过尾丝吸附于鸭疫里默氏菌的中部,开始感染过程;40min后细菌裂解,释放子代噬菌体。本研究为噬菌体作为抗生素替代品治疗鸭疫里默氏菌感染的研究提供了形态学依据。     

噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

为了研究副猪嗜血杆菌（HPS）外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和West—ernblot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc-145细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRR...     

噬菌体P1侵染大肠杆菌Nissle1917(EcN)机理研究

[目的]找出噬菌体侵染大肠杆菌的位点。[方法]选择血清型为O6∶K5∶H1的大肠杆菌Nissle 1917(Ec N)作为试验菌株。通过λ-RED系统,突变其K抗原和O抗原合成基因,通过检测P1转导至这一系列突变株的转导效率来确定P1的侵染位点。[结果]双突变株Ec NΔkfi AΔwaa G::Cm具有最高的转导效率。kfi A基因突变导致了K抗原缺失,waa G基因突变导致了LPS核心寡糖中第2位庚糖(HepⅡ)的暴露,使得P1更容易接触到HepⅡ,从而侵染细菌。[结论]研究认为HepⅡ很可能就是噬菌体P1的识别位点。     

沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及生物学特性的试验

从商品肉鸭场采集鸭粪及垫料,以实验室保存的沙门菌为宿主菌,采用双层平板法分离到1株烈性噬菌体。对分离到的噬菌体进行纯化、效价测定、裂解谱测定、形态观察,并且进行了最佳感染复数、温度跟p H值稳定性和一步生长曲线的生物学特性研究。结果表明,该噬菌体形成的蚀斑均匀透亮,效价能达到109PFU/m L以上,并能裂解多株沙门菌菌株,为宽裂解谱噬菌体,透射电镜显示,该噬菌体为长尾噬菌体;最佳感染复数为0.001;一步生长曲线测定表明,该噬菌体的潜伏期为15 min,暴发期为30 min,暴发量约为320;该噬菌体的温度、p H值耐受性良好;紫外线照射60 min后效价降低3个梯度,由此可见该噬菌体分离株可作为潜在开发的生物消毒剂菌株。     

我国对噬菌蛭弧菌的研究（三）

1.7蛭弧菌在死的宿主菌中的生长特性蛭弧菌Bd81、Bd98于加热及氯仿处理失活的宿主菌双层琼脂平板上,比在未经处理的活的宿主菌双层琼脂平板上更迅速形成噬菌斑,后者一般需40~48h才可出现噬菌斑。在加热及氯仿处理的宿主菌双层琼脂平板上只需14h,形成噬菌斑的数目也大大增多。例如在100℃加热致死的宿主菌中Bd81增加105倍,Bd98增加约72倍,在80℃加热致死的宿主菌中Bd81增加151倍,Bd98增加73倍。氯仿处理致死的宿主菌上Bd81增加74倍,Bd98增加67倍。