猪轮状病毒VP7蛋白模拟表位的噬菌体展示技术筛选与鉴定

猪轮状病毒(Po RV)是引起仔猪腹泻的重要病原之一,其主要结构蛋白衣壳蛋白VP7可诱导机体产生中和抗体。文章以制备的抗Po RV VP7单克隆抗体(MAb)3B6作为靶分子,利用噬菌体十二肽库展示技术对其模拟表位进行筛选。四轮筛选后随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定,同时提取其基因组DNA测序,10个阳性噬菌体亲和肽拥有共同的外源肽序列"VPLGTDNGDIWV",而且与靶分子有很高亲和力。阳性噬菌体亲和肽与VP7蛋白进行序列比对,结果表明,十二肽中有4个氨基酸(第167位P、第178位T、第179位D和第184位W)与VP7蛋白167~184位氨基酸有一定的相似性。竞争抑制ELISA证明亲和多肽降低Po RV与抗VP7单克隆抗体之间的作用,病毒竞争抑制试验表明亲和多肽可以竞争性地抑制Po RV感染细胞。因此由这4个氨基酸构成的基序很有可能作为猪轮状病毒VP7蛋白的一个模拟表位。     

噬茵体裂解基因E原核表达载体构建及大肠杆菌菌影的制备

根据Genbank已知序列,设计1对引物,采用PCR方法扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,经克隆、鉴定及序列测定分析,将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建了能够在大肠杆菌中表达裂解基因E的载体pGEX-E,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后成功获得了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗制备方法和新的疫苗佐剂奠定了基础.     

利用噬菌体随机肽库筛选胰腺癌特异性血清标志物

目的探讨利用噬菌体随机肽库筛选胰腺癌特异性血清标志物的可行性。方法纯化40例正常人和40例首次确诊的胰腺癌患者的血清免疫球蛋白,进行3轮噬菌体随机肽库的亲和筛选,并随机挑选20个克隆进行阳性鉴定,对阳性克隆进行DNA测序和对比分析。结果通过正常对照的阴性排除和3轮亲和筛选,噬菌体随机12肽回收率提高了500倍。随机挑选的20个克隆中有10个阳性克隆,经DNA测序分析获得4条多肽。阳性克隆的敏感性为100%,特异性为95%,阳性预测值为95.2%,阴性预测值为100%,准确性为97.5%。结论利用噬菌体随机肽库能够成功筛选出胰腺癌患者特异性血清标志物。     

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和La...     

多价噬菌体分离筛选及靶向灭活土壤病原菌的应用研究

农田土壤中残留和滋生多种病原菌会对人体健康和生态环境带来显著的安全隐患,开展针对性的生物修复研究十分迫切。噬菌体疗法靶向灭活土壤中病原菌的技术为修复此类污染土壤提供了全新途径。本研究以南京城郊某奶牛场牛粪堆积池周边,粪肠杆菌和假单胞菌复合污染农田土壤为例,首先筛选和纯化获得两株专一型噬菌体(YSZ1和YSZ5),再人为加速其宿主谱的表达过程,获得对应的多价噬菌体(YSZ1R和YSZ5K),并进行生物学特性(形态、核酸、最佳感染复数、一步生长曲线等)鉴定,结果表明:在水相和污染土壤中不同噬菌体对于同步灭活病原菌的能力依次为YSZ5KYSZ1RYSZ5YSZ1,并且施用多价噬菌体疗法有助于维护和改善修复后土壤微生物生态功能多样性与稳定性。本研究结果可为噬菌体疗法靶向灭活土壤中多种病原菌提供切实可行的修复技术。     

噬菌体裂解基因E原核表达载体构建及大肠杆菌菌影的制备

根据Genbank已知序列,设计1对引物,采用PCR方法扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,经克隆、鉴定及序列测定分析,将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建了能够在大肠杆菌中表达裂解基因E的载体pGEX-E,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后成功获得了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗制备方法和新的疫苗佐剂奠定了基础。     

噬菌体对养殖环境中鸡粪的消毒观察

近几年来我国养鸡事业发展非常迅速,但总体水平还处在初级发展阶段,尤其发展集约化养鸡时间还不长,出现了鸡粪在很短时间内造成污染环境和自家污染的问题。传统的鸡粪消毒方法存在着气味难闻、耗时间长等缺点,所以我们试着用噬菌体对鸡场养殖环境消毒,尤其是环境的主要污染对象———鸡粪进行消毒观察试验。     

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

从抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON毒素)杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段,再经重叠延伸PCR拼接扩增得到单链抗体基因(ScFv),克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上。然后转化感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,构建成抗DON毒素噬菌体单链抗体库,库容约为1.1×105,滴度为1.3×108pfu。随机选取10个克隆进行双酶切鉴定,结果显示均有ScFv基因片段插入。抗DON毒素单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达抗DON毒素单链抗体奠定了基础。     

东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础.用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA.在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端.用Mini Column纯化、收集300 bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库.经测定,库容量为1.3×107 PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011 PFU/mL.对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200 bp～1 000 bp,其中有95.5%的插入片段大于300 bp.用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%.     

噬菌体抗体库技术研究进展

噬菌体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因,将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(ScFv)与噬菌体外壳蛋白基因PⅢ或PVⅢ连接,使融合蛋白表达于噬菌体颗粒的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程富集筛选特异性抗体。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起,使识别抗原的能力和噬菌体的可扩增性统一起来,较好的模拟了体内的抗体产生的过程,成为一种高效的筛选体系。本文就噬菌体抗体库技术的原理、构建、筛选及其应用研究进展做一综述。