新生牛血清中大肠杆菌噬菌体检测方法的建立

本研究用大肠杆菌标准噬菌体株选择确定的大肠杆菌C-3000作为宿主菌,采用增殖法和噬斑法与双层琼脂平板法,对多个厂家的新生牛血清进行了大肠杆菌噬菌体检测,建立了兽用生物制品细胞培养用新生牛血清中大肠杆菌噬菌体的检测方法。     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。     

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX—IRES—GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX—Sox2-IRES—GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据．     

应用噬菌体快速检测沙门氏菌

应用沙门氏菌噬菌体Ｏ－Ｉ，对本实验室保存的１００个肠科菌株进行了裂解试验，其中３０株沙门氏菌４－６小时出现裂解斑，而其余的枸橼酸杆菌，大肠艾希氏杆菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌及变形杆菌等裂解反应全部为阴性。应用噬菌体和常规法对进出口动物产品鱼粉，肉骨粉，半年虫卵，蛤蚧及冻海鱼的２０个样品进行检测，前者发现１０个样品为沙门氏菌阳性，后者发现９个样品为沙门氏菌阳性，通过比较显示，应用噬菌体对进出口动物产     

重组新城疫病毒载体疫苗研究进展

新城疫病毒(NDV)作为疫苗载体可以在宿主的呼吸道组织细胞中有效复制,诱导产生针对外来抗原的局部和全身免疫反应。NDV的基因组较大,可以很好地容纳外源基因。作为RNA病毒,与宿主细胞发生DNA重组的可能性较小。由于宿主范围的限制,人群中没有预先存在的NDV抗体,NDV对人类来说相对安全。因此,NDV作为一种疫苗载体颇受关注。论文简要论述了NDV的生物学特征,外源基因的插入方式,重点阐述了重组新城疫病毒载体疫苗的研究进展,以期为设计其他有效的兽用和人用活载体疫苗提供参考。     

牛朊蛋白单氨基酸变异体的原核表达

应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒，即pGEX-BoPrP(93～241)、pGEX-BoPrP(93～241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93～241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93～241)(Q234R)。经转化E．coli BL21(DE3)．均表达了预期大小约为42．4ku的融合蛋白。在优化的诱导表达条件下，各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。经免疫印迹检查，所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11反应。表明，单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位。     

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物.运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy栽体上.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%.将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希茵细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒.     

猪流行性腹泻病毒在微载体培养Vero细胞上的增殖试验

为了探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)在微载体培养Vero细胞上的增殖效果,采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero细胞和PEDV繁殖,并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件,检测病毒滴度,与方瓶培养的病毒滴度进行比较。结果显示:当微载体为5 g,种子细胞数约3.05×107个,采用灌注式培养,Vero细胞经72 h长满单层,细胞数约为3.02×109个,此时用滴度为104.45TCID50/m L的PEDV 1 m L感染Vero细胞,培养96 h,微载体上80%细胞脱落时收毒,培养的PEDV具有较高的病毒滴度。相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代,经检测病毒滴度均有提高,但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/m L,明显高于方瓶培养。本试验为研究PEDV能更好适应Vero细胞,提高PEDV产量提供技术支持。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体的构建及其在293细胞瞬时表达

在293细胞中瞬时表达A/Chicken/Henan/1001/2010（H9N2）NS1基因蛋白,并对表达蛋白活性进行测定。试验利用PCR技术从NS1-T载体质粒上扩增NS1基因,将其克隆至pCAGGS载体,构建重组质粒NS1-pCAGGS;经酶切和测序鉴定正确后,重组质粒NS1-pCAGGS与脂质体按照一定比例混合后转染293细胞,用间接免疫荧光方法对瞬时表达细胞进行荧光信号反应。结果显示,禽流感NS1基因可以很好地在293细胞中瞬时表达,具有良好的反应原性。