甘青青兰Dt4CL基因过表达载体构建与生物信息学分析

4香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL)是黄酮类、木质素生物合成的关键酶之一,位于苯丙氨酸代谢途径的主途径向分支途径过渡的关键点上,控制进入不同的次生代谢支路以产生不同的次级代谢产物。本试验以甘青青兰(Dracocephalum tanguticum Maxim)为材料,利用PCR技术从甘青青兰中克隆出该家族成员一个基因,命名为Dt4CL1,利用双酶切及质粒重组法构建过表达载体Dt4CL1-PHB。对该基因编码的蛋白进行理化性质、疏水性、信号肽、二级结构、三级结构及系统进化树等生物信息学分析。结果显示该基因ORF全长1 719 bp,编码572个氨基酸,预测分子量为61.61 kD,理论pI为5.39。系统进化分析表明,Dt4CL1蛋白与丹参、夏枯草及小冠薰的4CL蛋白同源性最高。本研究结果为之后研究Dt4CL1的功能提供科学依据。     

固态抑氨菌剂制备及其对蛋鸡舍的抑氨效果

为了为抑氨菌选择良好的固定化载体,并研究固态抑氨菌剂对降低鸡舍内氨质量浓度的效果,该文将7种有机载体混合成63种组合载体后,选择较佳的组合载体,并以此制成固态抑氨菌剂。于饲喂1000只商品蛋鸡的笼养蛋鸡舍中,将固态抑氨菌剂均匀撒放于鸡粪表面,研究其在鸡舍现场的抑氨效果。菌剂的撒放按照菌剂与鸡粪质量之比进行,试验1期为0.5%,试验2期为1%,试验3期为1.5%,对照1期、2期和3期均不撒放,每天4次测定鸡舍内6个点的温度、相对湿度、氨质量浓度和CO2体积分数,试验共进行36d。结果表明,麦糠、稻壳和玉米芯粉等量混合并以200%吸水率吸附抑氨菌液后制成的固态抑氨菌剂的效果较佳;试验1期鸡舍内氨质量浓度未发生显著变化(P>0.05),试验2期氨质量浓度降低15%(P<0.01),试验3期氨质量浓度降低59.3%(P<0.01);但3期试验均未对舍内CO2体积分数产生显著影响(P>0.05)。结果显示,以有机混合载体吸附抑氨菌液制成的固态抑氨菌剂有明显降低笼养蛋鸡舍内氨质量浓度的作用。该研究结果为生产过程中有效控制蛋鸡舍内的氨质量浓度提供理论参考。     

Matrix蛋白和G蛋白双位点突变型水泡性口炎病毒的构建及生物学活性观察

重组水泡性口炎病毒(Vesiclar stomatitis virs,VSV)是一种具有良好应用前景的病毒载体,可应用于制备疫苗和治疗肿瘤,但该载体仍存在安全性问题,高剂量注射实验动物可导致产生神经毒性.为减低乃至去除野生型VSV的致病性,作者针对VSV毒力因子,构建了Matrix蛋白和G蛋白双位点突变型重组VSV,该病毒敲除了原来Matrix蛋白的第51位精氨酸和G蛋白C末端的28个氨基酸.相比野生型VSV,新病毒的致病性显著降低.试验也证实这个致弱的病毒是由于2种不同弱化机理共同作用所致,即Ⅰ型干扰素作用和复制能力减低.新型VSV病毒载体有希望成为一个更安全、有效的疫苗载体.     

饲用α-半乳糖苷酶酶活稳定性的研究

在酶制剂生产加工和储存过程中,酶活稳定性是酶应用过程中最常遇到的实际问题。本文研究不同载体、高温高湿、金属离子、保存初始pH值、保护剂浓度和存储时间对体外α-半乳糖苷酶稳定性的影响。试验结果表明:①无机载体碳酸钙、元明粉和滑石粉对α-半乳糖苷酶活性影响很大,收率均为0%;有机载体中玉米皮粉效果最好,收率高达90.83%;其次是淀粉,收率为61.11%;稻壳粉收率最低,仅为44.72%。②湿度为17%,温度小于85℃,酶活损失率小于10%,说明该酶有较强的耐温能力,温度为90℃,酶活损失率达到16.2%,随着温度上升,酶活损失率开始增加,不利于酶活的保存。③Cu2+对该酶有抑制作用3,7℃恒温水浴4 h后酶活存留率仅为74%,Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、K+和Mg2+对α-半乳糖苷酶有几近相同的保护作用,酶活存留率均大于92%。④该酶最适保存pH值为5.3;pH值为4.4时,酶活损失率达到30.1%,不利于酶的保存;pH值为5.6时,酶活损失率为3.77%,pH值在4.7~5.6之间,酶活损失率小于10%,有利于酶的保存。总之,过酸和过碱都不利于酶的保存。⑤1%NaCl、1%甘露醇、5%和7%的山梨醇都有杂菌产生,不利于酶的保存3;%~5%的NaCl酶活损失小于10%1,%和5%~7%的甘油酶活损失率小于5%,都有利于酶活保存。     

I型小肽载体的结构及活性调控研究进展

本文综述了I型小肽载体的结构特征及影响其活性的调控因素。     

结核分枝杆菌蛋白TB9.7间接ELISA方法的建立

为获得新的鉴别诊断结核杆菌感染的候选抗原,根据Gene Bank中登录的结核杆菌H37Rv的TB 9.7基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到TB 9.7基因DNA片段。将该扩增片段克隆于PMD18-T载体中,得到载体PMD18-T-TB9.7。分别将pET32a质粒和PMD18-T-TB 9.7质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,并将纯化的TB 9.7基因亚克隆至pET32a中,获得重组表达质粒pET32a-TB 9.7。将其转化E.coli BL21 IPTG诱导后,经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,可见约30ku的外源蛋白带。表明TB9.7基因在大肠杆菌中得到了表达。用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的TB9.7融合蛋白,建立间接ELISA诊断方法,检测了30份结核病人的痰检阳性血清,120份健康人的血清,敏感性为56.6%,特异性为97%,与痰检结果的符合率为84%。     

产志贺毒素多重耐药大肠杆菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析

为探明大肠杆菌噬菌体的生物学特性和全基因组特征,本研究以在广西某猪场污水中分离得到的1株产志贺毒素且多重耐药的大肠杆菌GXEC010为宿主菌,同时在污水中分离到1株具有裂解作用的噬菌体,并通过透射电镜观察、最佳感染复数测定、一步生长曲线绘制、热敏感性与酸碱度稳定性评估、杀菌试验及全基因组测序等方法分析该噬菌体的生物学特性与基因组特征。结果表明,分离纯化得到能高效裂解大肠杆菌GXEC010的噬菌体,命名为vB_EcoM_BP10,其噬菌斑呈清晰透明,边缘光滑整齐;该噬菌体的最佳感染复数为1;一步生长曲线结果显示,感染宿主菌潜伏期为5 min,爆发期为65 min,爆发量为51;可耐受温度范围为30~60 ℃,在pH为5~8的环境中能维持稳定性;噬菌体杀菌试验结果显示,感染复数（MOI）为1时噬菌体vB_EcoM_BP10具有良好的杀菌效果。全基因组测序结果表明,噬菌体vB_EcoM_BP10基因组总片段长度为52 288 bp,GC含量为44.16%,含有71个阅读框（ORF）。GO功能注释表明,噬菌体vB_EcoM_BP10可参与小分子代谢、细胞氮化合物代谢等生物学过程中,具备核苷酸转移酶活性、离子结合、DNA结合等分子功能。与Escherichia phage ST32、 Enterobacteria phage phiEcoM-GJ1的亲缘关系较近。综上所述,噬菌体vB_EcoM_BP10具有清晰的宿主受体特异性,良好的热稳定性和酸碱稳定性,本研究结果能为有效防控产志贺毒素多重耐药大肠杆菌奠定一定的理论基础。     

饲料中不同载体物质对VB1检测的影响

试验研究添加4种载体(膨润土、麦饭石、石粉、滑石粉)的原料及饲料中维生素B_1的回收率,以此判断不同载体对维生素B_1检测的影响。试验结果表明,在饲料原料和多维饲料中添加膨润土后,VB1的回收率分别为0.4081%、43.86%、麦饭石的回收率为83.59%、90.70%,石粉的回收率为100.48%、97.36%,滑石粉的回收率为101.68%,101.00%,说明膨润土对维生素B_1的检测影响较大,检测结果回收率较低,其他载体影响较小。     

猪CR1-like蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定

为了研究猪红细胞免疫粘附病原体的分子机制,筛选能与猪红细胞类补体受体I型(CR1-like)蛋白发生相互作用的蛋白,将CR1-like36和Cr1-like811基因与pGBKT7载体连接后,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811。转化入酵母细胞Y2HGold中,检测融合蛋白的表达及其对酵母细胞的毒性和自激活现象。结果表明,CR1-like基因成功连接到pGBKT7载体,重组质粒表达的融合蛋白对酵母细胞无毒性作用,也无自激活现象。成功构建了符合酵母双杂交系统要求的诱饵质粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811,为课题组后期研究猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的分子机理奠定基础。     

生物工程——农业发展的最终出路

<正>由中国农业科学院生物技术研究所完成的"利用玉米种子生物反应器生产高活性植酸酶"项目,日前通过农业部组织的科技成果鉴定。由李振声院士等国内著名遗传育种、分子生物学和动物营养学专家组成的鉴定委员会一致认为:以玉米为载体生产的第二代植酸酶产