重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

分子生物学技术的发展,使得疫苗研究正逐渐从传统的灭活和弱毒疫苗向基因工程疫苗过渡,特别是以病毒和细菌为活载体疫苗的研制,以期克服常规疫苗在免疫时出现的毒力返强和散毒、免疫效率较低、过敏反应、用量较大等弊端.     

草菇gpd启动子的克隆及表达载体的构建

从草菇基因组中克隆内源强启动子,为草菇基因工程育种提供启动子元件材料。［方法］采用PCR技术从草菇基因组DNA中克隆gpd启动子片段,利用生物信息学手段对其序列特征和调控元件进行分析,并构建表达载体。［结果］从草菇基因组中克隆出2条特异gpd启动子片段,大小分别为1056和614bp;成功构建了分别以这2条启动子片段驱动的、以gfp基因为报告基因的2个表达载体。［结论］该研究为进一步利用基因工程手段培育品质优良的草菇新菌株奠定了基础。     

噬茵体裂解基因E原核表达载体构建及大肠杆菌菌影的制备

根据Genbank已知序列,设计1对引物,采用PCR方法扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,经克隆、鉴定及序列测定分析,将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建了能够在大肠杆菌中表达裂解基因E的载体pGEX-E,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后成功获得了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗制备方法和新的疫苗佐剂奠定了基础.     

鹅副黏病毒HN基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果

以大量提取的鹅副黏病毒(GPMV)HN基因真核表达载体pVAXⅠ-HN和空载体pVAXⅠ肌肉注射BALB/c小鼠。利用MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,用ELISA方法检测小鼠血清中GPMV抗体,观察GPMV HN基因真核表达载体pVAXⅠ-HN在小鼠中的免疫效果。结果表明:试验组小鼠血清中GPMV特异性抗体水平显著高于对照组,ELISA试验结果OD492值分别为1.360 0±0.101 7和0.358 0±0.018 1;试验组与对照组的淋巴细胞增殖试验刺激指数(SI)差异不显著,其SI值分别为1.181 2±0.030 1和1.119 1±0.035 5。由此说明,GPMV HN基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫。     

猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/ Swine/ Inner Mongolia/ 547/ 01 (H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD 18-T载体.重组pMD 18-T经Sal I 和 EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的Sal I/EcoRI位点.PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体.这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础.     

杂合抗菌肽Cec Md-CheRc的分子设计及其克隆载体的构建

为了获得具有高抗菌活性和低溶血活性的抗菌肽,利用家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin,设计出杂合抗菌肽Cec Md-Che Rc,并构其克隆载体。选取Cec Md的N端和Chensirin的C端氨基酸序列组成杂合肽,通过互联网和计算机软件,分析比较杂合肽的特征参数并进行结构预测。采用重复序列PCR方法合成2条杂合肽Cec Md-Che Rc I和Cec Md-Che Rc IV的基因,并连接到克隆载体pMD18-T上。分析发现杂合抗菌肽中Cec Md-Che Rc I疏水性最强,Cec Md-Che Rc IV净正电荷数最高;两者N端为疏水性α螺旋结构,C端为亲水性α螺旋结构;两者疏水性氨基酸大体分布在螺旋轮的一侧,其余氨基酸分布在另一侧;带正电荷的氨基酸主要分布在亲水面上。2条杂合肽的基因大小分别为133 bp和124 bp;PCR、双酶切和测序鉴定表明成功地构建了克隆载体pMD18-T/Cec Md-Che Rc I和pMD18-T/Cec Md-Che Rc IV,为后续研究奠定了基础。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白筛选噬菌体展示抗原对小鼠血吸虫病免疫效果观察

在前期研究中我们利用日本血吸虫抱雌沟蛋白筛选日本血吸虫噬菌体展示cDNA文库,共获得10种阳性噬菌体克隆。本研究选择其中5种噬菌体克隆单独或联合免疫小鼠,观察其对血吸虫成虫合抱的影响以及对血吸虫病的免疫预防效果。结果显示,19号克隆单独免疫和6号、18号混合免疫在预防实验中分别取得了40.53%和31.14%的减虫率及35.31%,44.65%的肝脏减卵率。研究结果提示,19号、6号和18号噬菌体展示的EST序列编码基因具有一定的抗血吸虫生殖免疫效果,在血吸虫疫苗研究方面具有重要价值。     

枯草芽孢杆菌apr基因表达载体的构建

利用PCR技术和基因重组技术构建了枯草芽孢杆菌蛋白酶基因—apr的重组表达质粒PET-22b/apr,并将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21中,经蓝白斑筛选获得apr的表达载体。PCR后经琼脂糖凝胶电泳结果显示,在约1.5kb位置有特异性条带,与预期的枯草芽孢杆菌蛋白酶基因大小一致。重组质粒pGM-T/apr经双酶切后获得约1509bp的apr基因片段,同预期结果相一致,测序结果同GeneBank中的序列同源性达到100%。未发生任何突变。表明重组质粒pET-22b/apr构建成功。     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.     

番茄LeABI3基因的克隆与植物过量表达载体的构建

从番茄成熟种子中提取总RNA,反转录得到cDNA.根据GenBank中番茄LeABI3基因序列设计引物,通过PCR方法获得了番茄LeABI3基因的2个转录本,其中转录本1序列比GenBank中LeABI3基因编码区序列多出30 bp,含1个1 740 bp的开放阅读框,编码579个氨基酸;转录本2比GenBank中LeABI3基因编码区序列也多出30 bp,同时在编码区内另一个位置因剪接而缺失了122 bp的核苷酸序列.通过替换掉植物过量表达载体PBI121上的GUS编码区序列,将序列无缺失的转录本1连接到PBI121上,对所获得的重组质粒进行双酶切,结果表明植物过量表达载体PBI121-LeABI3构建成功.