基于转录组测序的半滑舌鳎长链非编码RNA的初步鉴定与分析

以抗病家系与易感家系半滑舌鳎为材料,进行哈维弧菌感染实验,并对易感家系感染前(CsSU)、易感家系感染后(CsSC)、抗病家系感染前(CsRU)、抗病家系感染后(CsRC)4组进行转录组测序,根据RNA-seq数据挖掘半滑舌鳎长链非编码RNA信息;通过生物信息学分析,筛选出与抗哈维弧菌病相关的差异长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。结果显示,共识别出4 584个lncRNA座位,包含5 714个转录本;其基本特征与编码基因的比较分析,lncRNA的GC含量低于编码基因,单外显子基因数多于编码基因,转录本的平均长度长于编码基因,基因表达量低于编码基因。对4组样品进行两两比较(CsRU vs CsSU、CsRC vs CsSC、CsRC vs CsRU、CsSC vs CsSU)分别筛选出818、813、261、140个差异表达lncRNA,其中CsRU与CsSU之间、CsRC与CsSC之间lncRNA数目差异最多,通过聚类分析确定了各实验组的表达模式之间的联系,CsRU与CsSU之间的表达模式最为相近。通过共表达分析,预测出lncRNA和274个编码基因可能存在14 539种相互关系,并进行了功能注释,进而筛选出7个关键lncRNA。qRT-PCR结果显示,差异表达lncRNAs的表达模式和转录组数据得到的基本一致。研究结果为揭示lncRNA在半滑舌鳎抗哈维弧菌免疫调控反应中的作用提供重要的参考数据。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

不同施肥模式下的稻-克氏原螯虾田块水体菌群初探

为研究不同施肥模式对稻田养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii)田块水体细菌的影响,通过采用Illumina高通量测序技术针对施用化肥(CF)、有机肥(OF)和有机肥加腐熟鸡粪(OM)等3种施肥模式的水体细菌进行检测。高通量测序结果显示在3种不同施肥模式下的稻田中主要细菌门类均为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。主要优势菌属为Sporichthyaceae hgcl_clade、Limnohabitans、Polynucleobacter、Alpinimonas、Comamonadacea和Hydrogenophaga。在3种模式中,施用有机肥的田块细菌丰度显著高于施用化肥和有机肥加腐熟鸡粪的田块,细菌物种多样性显著高于施用有机肥加腐熟鸡粪田块,与施用化肥田块差异不显著。结果表明在施用有机肥模式下,水体微生物具有更好的多样性,生态系统更加稳定。有机肥与腐熟鸡粪配施虽然会降低水体细菌的物种多样性,但是腐熟鸡粪与有机肥配施会大大降低蓝藻细菌的丰度。聚类分析结果显示有机肥组与有机肥加腐熟鸡粪组水体细菌群落相似度更高。对稻田水体细菌与水体理化因子关联分析发现,对水体细菌影响最主要的环境因子是溶氧、总氮、pH和总磷。研究结果为不同施肥处理对稻田水体生态环境的影响以及为稻田综合种养施肥模式优化提供理论依据。     

鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1融合基因的原核表达

目前在针对鱼类神经坏死病毒的疫苗研究中,主要是将神经坏死病毒某些蛋白作为抗原进行注射免疫,但是传统的注射免疫并不能有效地激发黏膜免疫。笔者将鱼类神经坏死病毒的衣壳蛋白（MCP）与鮰爱德华氏菌的跨粘膜蛋白ompN1融合表达,拟制备能够抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗;利用从NCBI GenBank库里获得的鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌的外膜蛋白ompN1的基因序列,将两者进行序列优化与全基因合成,分别构建原核表达载体:MCP-ompN1 pET28a和MCP pET28a和ompN1 pET28a,并在大肠杆菌内分别诱导表达融合蛋白MCP-ompN1,MCP,ompN1后,再利用包涵体纯化及透析复性获得MCP-ompN1,MCP,ompN1蛋白。SDS-PAGE结果显示,原核表达纯化得到了较纯的MCP-ompN1 融合蛋白,Western Blotting结果表明,纯化得到的MCP-ompN1 融合蛋白不仅具有MCP抗原性,还具有ompN1抗原性。本实验通过原核表达纯化得到了鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白MCP-ompN1,为进一步验证融合蛋白MCP-ompN1能否作为抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗奠定了基础。     

溶珊瑚弧菌hapR基因的敲除及功能研究

溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)是多种珊瑚的致病菌。hapR是弧菌群体感应系统核心的泛调控基因。前期实验中发现,溶珊瑚弧菌在感染佳丽鹿角珊瑚时,致病力与其接种密度密切相关,推测溶珊瑚弧菌的群体感应系统可能是调控其毒力的关键因子。笔者利用同源重组技术成功构建了溶珊瑚弧菌hapR缺失株△hapR-Vc450和回补株ChapR-Vc450,表型测试结果表明,hapR的缺失影响溶珊瑚弧菌的菌落形态,但不影响细菌的运动性和鞭毛结构;hapR缺失后,细菌最大生长量明显减少,但生物膜的形成量显著增加;用溶珊瑚弧菌人工感染鹿角珊瑚,结果显示,hapR缺失后菌株毒力增加,表明hapR在溶珊瑚弧菌中可能具有与霍乱弧菌hapR相似的功能,可以抑制毒力基因的级联激活。     

蚜虫共生细菌多重PCR检测体系的建立

蚜虫中具有多种共生菌,使用常规PCR对它们进行检测,耗时耗力,而多重PCR可以更加高效地进行多种细菌的检测。沃尔巴克氏菌Wolbachia pipientis、杀雄菌属共生菌Arsenophonus和蚜虫U型共生菌Regiella insecticola是蚜虫中常见的3种共生菌。本研究针对沃尔巴克氏菌、杀雄菌属共生菌和蚜虫U型共生菌,分别选择以wsp基因、yaeT基因和gltA基因作为靶标,进行了多重PCR引物的设计和扩增体系的优化。结果显示,本研究建立的多重PCR体系在检测3种蚜虫常见共生菌时,具有较高的扩增特异性、准确性和直观性及较高的检测灵敏度,共生菌的最低检测浓度为104拷贝/μL,远低于共生菌在蚜虫1龄若虫总DNA中的浓度(108拷贝/μL),可以完全满足蚜虫共生菌检测工作的需要。     

林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子的原核表达

为研究林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372的功能,采用PCR方法扩增林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子kp05372基因,连接T载体进行克隆,双酶切后连接表达载体pET-32(a),构建重组表达质粒,并转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞,然后对其最佳表达时间、温度、IPTG浓度进行筛选,利用SDS-PAGE与Western Blot鉴定重组蛋白,得到约53.2 ku的融合蛋白,与预期大小一致。本研究成功构建kp05372基因表达载体,并筛选出最佳表达条件,为进一步研究该蛋白结构功能奠定了基础。     

菌剂与钾肥配施对连作魔芋生长、生理代谢和发病率的影响

以安康当地花魔芋为材料进行盆栽试验,研究娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）菌剂D74与钾肥配施对连作魔芋生物学性状、块茎产量、叶绿素含量、活性氧代谢、渗透调节物质含量及软腐病的影响,为魔芋连作障碍微生物-化学双重修复提供理论依据。结果表明：菌剂与钾肥配施对连作魔芋具有一定的促生防病作用,使魔芋单株块茎鲜质量和生长系数分别较对照显著增加86.7%和85.9%,软腐病病情指数降低 33.0%。配施处理中,钾肥和菌剂分别在促进魔芋块茎膨大和抑制软腐病方面发挥主导作用。菌剂与钾肥配施促进魔芋叶片叶绿素的合成,其叶绿素a及叶绿素(a+b)含量分别较对照显著增加51.0%及34.6%,同时叶绿素a/b及叶绿素(a+b)/类胡萝卜素比值分别提高41.8%及22.2%。配施的菌剂效应对叶绿素合成的促进作用占主导地位。菌剂与钾肥配施显著提高魔芋的诱导抗性,其叶片过氧化物酶活性、可溶性蛋白和可溶性糖含量分别为对照的3.1倍、2.9倍和2.2倍。采用主成分分析法对魔芋相关19个生理生化指标分析得出特征值、贡献率、累积贡献率和主成分载荷矩阵,提取3个主成分（叶绿素b、叶幅和相对防效）综合评价菌剂与钾肥配施对魔芋连作障碍的修复效果。不同施肥处理综合得分高低顺序为：菌剂与钾肥配施>单施钾肥>单施菌剂>不施肥对照。综上所述,娄彻氏链霉菌菌剂D74与钾肥配施能提高连作魔芋产量并降低植株发病率,有效缓解连作障碍。     

基于LMDI的长江经济带农业用水驱动因素分析

水资源优化配置成为长江经济带农业农村绿色发展的核心议题,厘清农业用水量变化的内在驱动因素及影响效应是关键。基于2002—2017年长江经济带11个省(市)的面板数据,利用对数平均迪氏指数法(LMDI)将农业用水影响因素分为技术水平、产业结构、生产水平和人口规模,进而分析不同因素对农业用水变化的效应。结果表明,从总体来看,产出效应和人口效应促进农业用水增长,其中产出效应占主导地位;技术效应和结构效应对农业用水量起抑制作用。从区域来看,上海市、安徽省、江西省、湖北省、重庆市、四川省和贵州省总体对农业用水起促进作用,江苏省、浙江省、湖南省和云南省总体对农业用水起抑制作用。     

浙江省哈摇蚊属种类记述

依据浙江省已有标本,详细描述了浙江省短叶哈摇蚊[Harnischia curtilamellata(Malloch,1915)]、截铗哈摇蚊[Harnischia japonica(Hashimoto,1984)]、叶突哈摇蚊[Harnischia tenuitubercula(ChaudhuriChattopadhyay,1990)]和膨铗哈摇蚊[Harnischia turgidula(WangZheng,1993)]等4种哈摇蚊属,并附主要特征图和分种检索表。以上4种均为浙江省新记录种,其中叶突哈摇蚊为中国新记录种。