畜牧兽医科技文摘

单核细胞增生李斯特菌野毒株prfA基因的克隆及其分子特征分析/孟庆玲（石河子大学动物科技学院新疆石河子832000）,乔军,才学鹏…//中国兽医科学.-2011,41（3）.-250～255利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌（LM）TA野毒株prfA基因进行扩增,将其克隆后测序,并对该分离株prfA基因及其编码蛋白...     

食源性单增李斯特菌LIPI-4基因的检测及序列分析

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对公共安全及畜牧业发展威胁极大。其毒力岛4(LIPI-4)是新发现的一个潜在毒力因子,与LM的神经感染和母胎感染密切相关。以54株食源性LM的DNA为模板,针对LIPI-4的6段基因设计特异性引物,利用PCR的方法检测LIPI-4的携带情况并对携带株的LIPI-4基因进行生物信息学分析。结果表明,54株LM中有5株携带LIPI-4基因,携带率为9.26%;5株食源性LM LIPI-4基因的同源性均为100%,与CC1代表株LM09-00558 LIPI-4基因的同源性99%以上;对LIPI-4中EIIC结构域分析表明5株食源性LM LIPI-4均为PTS~(Lac)家族。食源性LM携带LIPI-4基因且属于PTS~(Lac)家族,研究LIPI-4基因对进一步了解LM的致病性具有重要意义。     

甘肃省畜禽肉品中单核细胞增生李斯特菌污染情况的调查

采集甘肃省兰州市、定西市、张掖市、酒泉市和庆阳市等地区部分屠宰场和农贸市场共1 387份样品。通过常规细菌学和分子鉴定方法对样品进行单核细胞增生李斯特菌分离鉴定,并对分离菌株的耐药性、血清型以及生物被膜形成能力进行测定。1 387份样品中共分离出14株单核细胞增生李斯特菌,总分离率为1.0%。选择12种抗菌药物进行纸片扩散法(KB)药敏性检测,结果表明分离菌株对四环素和头孢噻吩耐受最严重,耐药率为100%。青霉素、乙酰螺旋霉素、复方新诺明、红霉素、磷霉素和多黏菌素,多重耐药严重。血清型鉴定结果表明1/2a血清型菌5株(35.7%),1/2b血清型菌2株(14.3%)1/2c血清菌6株(42.9%),4b血清型菌1株(7.1%)。同时,分离株均能形成生物被膜,其中1/2a、1/2b和1/2c血清型菌株形成生物被膜的能力较强。研究表明,甘肃省畜禽肉品中存在单核细胞增生李斯特菌污染,农贸市场中污染最严重,相关部门应加强监控,从而预防食源性疾病的发生。     

单核细胞增生李斯特菌qPCR检测方法的建立及应用

【目的】为了建立一种快速、准确、可靠的畜产品中单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测方法。【方法】根据保守序列设计并筛选出一对特异性引物,经过反应体系及程序优化,建立染料法qPCR检测方法,并使用临床样品评价该检测方法的效果。【结果】建立的qPCR方法特异性较好,扩增,对纯培养细菌的检测限可达到10² CFU/mL,检测方法变异系数小,稳定性高;对生猪肉和牛奶人工污染模型中的检测限为10³ CFU/mL,比普通PCR灵敏度高10倍。使用qPCR分别对50份牛奶样品和生猪肉样品检测,阳性率均为2.00%,与普通PCR方法验证结果一致。【结论】成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品单核细胞增生李斯特菌的检测。     

LIPI-4 EII对单核细胞增生性李斯特菌关键毒力因子转录调控的影响

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶(EII)对LM毒力基因表达的调控作用,本研究分别构建EII缺失株(LM928ΔEII)、强启动子回补株(CLM928ΔEII-P_help)和天然启动子回补株(CLM928ΔEII-P_native),测定各菌株在体外培养中的生长曲线和在永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)内的增殖情况;RT-qPCR检测体外培养和HCMEC/D3细胞内各菌株9个关键毒力基因的转录水平。结果显示:1)EII基因缺失株LM928ΔEII构建成功,重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-P_native及回补株CLM928ΔEII-P_help和CLM928ΔEII-P_native构建成功。2)在体外培养下,EII对LM的生长曲线没有影响。但在侵染HCMEC/D3后,LM928ΔEII在8和12 h的胞内细菌量显著高于LM928(P<0.05),2和4 h的胞内细菌量极显著高于LM928(P<0.01),CLM928ΔEII-P_native在2、4和6 h恢复至野生株水平(P>0.05),而CLM928ΔEII-P_help在2、4、6、8、10和12 h均极显著低于野生株(P<0.01)。3)体外培养条件下,相比于野生株,LM928ΔEII中66.7%(6/9)的毒力基因转录水平极显著上调(P<0.01);CLM928ΔEII-P_help中66.7%(6/9)的基因转录水平上升1~4倍,CLM928ΔEII-P_native中88.9%(8/9)的基因转录水平倍数变化在1倍以内。在HCMEC/D3细胞内,相比于野生株,LM928ΔEII中66.7%(6/9)的毒力基因转录水平极显著上调(P<0.01);CLM928ΔEII-P_help中33.3%(3/9)的基因转录水平上调1~3倍,CLM928ΔEII-P_native中基因转录水平倍数变化在1倍以内。综上,LIPI-4 EII对LM关键毒力因子的转录具有负调控作用。本研究为系统探究LIPI-4参与LM致病性机制奠定基础。     

SigmaB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌毒力的影响

为了解缺失SigmaB基因对单核细胞增生性李斯特菌（LM）的毒力影响。通过体外生长试验、巨噬细胞RAW264.7的粘附与侵袭试验、小鼠肝脾载菌量试验、毒力基因转录水平试验、小鼠LD₅₀试验来研究缺失株（LM XS5 △SigmaB）的毒力变化。结果显示,与野毒株相比,缺失株体外生长能力减弱、侵袭率和粘附率降低,小鼠肝脾载菌量显著减少,毒力基因（inlA、inlB、hly、prfA、actA）的转录水平降低,而小鼠LD₅₀升高。可见,SgmaB基因对LM的毒力具有重要的调控作用,为LM基因缺失疫苗和活疫苗载体的研发可资借鉴。     

硒化乌拉尔甘草多糖和乌拉尔甘草多糖对单核细胞增生李斯特菌抗菌活性的研究

为了比较硒化乌拉尔甘草多糖(selenizing Glycyrrhiza uralensis polysaccharide, SeGUP)和乌拉尔甘草多糖(Glycymhiza uralensis polyacchiade, GUP)对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene,Lm)体内、体外抗菌活性,试验采用药敏纸片方法分别测定Lm对480 mg/mL、240 mg/mL、120 mg/mL GUP和SeGUP的敏感程度;采用微量肉汤稀释法测定SeGUP和GUP对Lm的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);设置SeGUP和GUP高剂量(240 mg/mL)组、中剂量(120 mg/mL)组、低剂量(60 mg/mL)组,各组分别与Lm混合培养24 h,每2 h取样测定OD₆₀₀值,观察SeGUP、GUP对Lm生长速率的影响;检测各组4小时时的培养上清液中的碱性磷酸酶(AKP)、β-半乳糖苷酶活性及蛋白质总含量;用结晶紫染色法检测SeGUP和GUP各剂量组对Lm生物被膜形成能力的影响;分别按体重灌胃小鼠SeGUP、GUP 300 ...     

应用MTT测定PBMC增殖最佳条件的研究

对ＭＴＴ（噻唑蓝）测定离休ＰＢＭＣ（外周血单核细胞）增殖最佳实验条件进行了研究,结果表明,在测定由不同有丝分裂原（ＰＷＭ、ＳＥＢ和ＣｏｎＡ）诱导的ＰＢＭＣ增殖中,ＭＴＴ的Ｏ．Ｄ值和表示３￣Ｈ一ＴｄＲ摄取量的ｃｐｍ值呈正相关（ｒ＝０．９１５～０．９８２,ｐ＜０．０５,ｐ＜０．０１）。在ＰＢＭＣ密度为２．５×１０￣５／孔、孵育时间为４ｄ～６ｄ的条件下Ｐ／Ｈ比值最大,此外,细胞培养基中的血清种类及其浓度也是重要的影响因素。ＭＴＴ的浓度及催化形成噻唑盐的时间在达４ｈ后对Ｐ／Ｎ比值影响不大。所有这些表明,只要选择最佳条件,应用非同住素标记的ＭＴＴ法可在科研和常规检验时测定畜禽ＰＢＭＣ增殖。