介绍鱼类组织中蛋白质及同功酶的电泳方法

<正> 近年来用醋酸纤维薄膜、琼脂糖、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持物的电泳分离技术,对生物的各种组织蛋白及同功酶的研究已广泛应用。目前利用蛋白电泳和同功酶谱的变化来鉴定鱼类、了解种的地理分布、生理情况以及遗传育种、生物进化等方面已成为一种有效的实验生化技术。几年来,我们摸索了一些方法,通过实验在某些方面作了改进,效果较为满意,现将方法和经验分别作介绍,供参考。     

刺芹侧耳不同生长发育阶段漆酶基因家族表达

测定刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)不同生长发育阶段(菌丝体期、扭结期、原基期、幼菇期和子实体期)栽培基质木质素含量和漆酶活性,并通过实时荧光定量PCR方法检测栽培基质菌丝中漆酶基因家族10个基因表达情况.结果显示:在子实体发育过程中,栽培基质木质素含量先降低后升高,扭结期含量最低,为6.49％;幼菇期和...     

奶牛隐性乳房炎诊断方法研究进展

乳房炎是造成奶牛养殖业经济损失最为严重的疾病之一。导致奶牛乳房炎的病因很多,即使进行了适当的干奶期护理和提供了良好的饲养环境,仍然会有5%左右的奶牛患乳房炎,患病后不仅影响乳汁品质,严重的还可导致奶牛乳腺的器质性损伤。临床型奶牛乳房炎一旦发生,奶牛大概率会被淘汰,所以,奶牛隐性乳房炎的早期诊断尤为重要。本文对奶牛隐性乳房炎的诊断方法进行综述,为临床防治提供参考。     

发芽绿豆苗的生理指标和抗氧化特性对邻苯二甲酸酯的响应特征

Single phytotoxicity of two representative phthalate esters （PAEs）, di-n-butyl phthalate （DnBP） and bis（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP）, was tested in mung bean （Vigna radiata） seedlings germinated for 72 h in soils spiked with varying concentrations （0-500 mg kg-1 soil） of DnBP or DEHP. PAEs added at up to 500 mg kg-1 soil exerted no significant effect on germination but both pollutants significantly inhibited root elongation （P 〈 0.01）; DEHP inhibited shoot elongation （P 〈 0.01） and DnBP depressed biomass on a fresh weight basis （P 〈 0.05）. Seedling shoot and root malondialdehyde （MDA） Contents tended to be stimulated by DnBP but inhibited by DEHP. However, increases in superoxide dismutase, peroxidase, ascorbate peroxidase and polyphenol oxidase activities, as well as glutathione （GSH） content, were induced at higher concentrations （e.g., 20 mg kg-1） of both compounds. Accumulation of proline in both roots and shoots and the storage compounds, such as free amino acids and total soluble sugars, in whole plant was induced under the stress exerted by both PAEs. The general responses of mung bean seedlings indicated higher toxicity of DnBP than DEHP on primary growth, during which root elongation was a more responsive index. MDA and GSH were more sensitive parameters in the roots than in the shoots and they might be recommended as physiologically sensitive parameters to assess the toxicity of PAE compounds in soils in future long-term studies.     

玉米皮多酚提取工艺优化及抗氧化性研究

为探究超声辅助酶解法提取玉米皮多酚的最优工艺,并探讨其体外抗氧化活性,以玉米皮多酚提取量为响应值,分别考察超声时间、提取温度、料液比和酶添加量4个因素对提取效果的影响。在单因素试验的基础上,采用中心组合响应面分析法对提取工艺进行优化。结果表明,最佳提取条件为:超声时间6.5 min、酶解温度55℃、液料比41 mL·g^-1、木聚糖酶添加量2.10%,此条件下,玉米皮多酚提取量最高,为7.26 ± 0.15 mg·g^-1,与响应面预测值7.17 mg·g^-1相近。DPPH·和ABTS⁺·清除法抗氧化试验结果表明,玉米皮多酚具有较强的抗氧化能力,可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品行业。本研究结果为玉米加工副产物玉米皮综合应用提供了理论依据。     

用于生物质酶解过程的纤维素酶研究进展

纤维素酶解效率是木质纤维素经济、高效生化转化的限制瓶颈。该文讨论了影响纤维素酶酶解经济性与高效性的多个要素,如:高滤纸酶活菌株的选育、发酵、酶解机理、酶解影响因素及酶解混合体系的优化等。该文研究表明,纤维二糖水解酶可能是决定发酵体系中滤纸酶活高低的关键单酶组分,同时,该酶可能也是预处理后生物质酶解体系中决定滤纸酶活效率的关键单酶组分。酶解过程中关键限速反应的认识及关键限制因素形成机制的揭示将成为纤维素酶生化转化研究的重点,这些机理机制的建立可为构建高比活力纤维素酶提供理论依据。     

葡萄β型液泡加工酶基因(VvβVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.     

普鲁兰酶氮端氨基酸的截短对其酶学性质的影响

淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域.普鲁兰酶(pullulanase,pulA,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α-1,6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率.因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义.课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pulA基因(GenBank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中异源表达.为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45 ℃,二者的最适pH分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204U/mg,是M1的1.6倍.动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.001 3μmoL/(mL·s)-1、191.80-1 s.-1、0.30 mg/mL、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍.本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路.     

酶解牦牛血发酵液制备抗氧化肽工艺优化

为进一步提高牦牛血枯草芽胞杆菌发酵液多肽含量,对牦牛血发酵液进行酶解,以酶解液的·OH清除率、多肽含量为主要指标,筛选酶解发酵液的最适蛋白酶,通过单因素和响应面试验优化酶解工艺,并对比菌酶联合制备产物与发酵液体外抗氧化活性。结果表明,碱性蛋白酶酶解发酵液最佳条件为:酶解时间3 h、p H值9.5、酶解温度60℃和酶底比190 U·g-1,此条件下制备得到酶解液多肽含量为5.52mg·mL~(-1),较发酵液提高2.39倍。菌酶联合制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为6.22、4.87mg·mL~(-1),发酵法制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为8.42、11.71 mg·mL~(-1),且菌酶联合制备产物的还原力优于发酵制备产物。因此,菌酶联合制备牦牛血抗氧化肽法优于传统单一发酵法。本研究结果对提高牦牛血抗氧化肽得率,增加牦牛产品附加值具有重要的意义。     

不同脆化阶段草鱼肠道菌群动态变化、血清酶指标及生长性能

本研究旨在探讨草鱼(Ctenopharyngodon idellus)不同脆化阶段的肠道菌群组成结构、血清酶活性及生长性能,进而衡量脆肉鲩形成过程中的生理生化变化,以期为脆肉鲩的健康养殖提供科学数据.脆化不同阶段(30、60、90和120 d)的草鱼,在脆化结束后转投喂人工配合饲料30 d(第150天),鉴定整个过程中草鱼肠道菌群组成、血清酶活性和生长性能的变化.结果表明,60～150 d蚕豆组草鱼体重均低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),90～120 d蚕豆组草鱼头肾体指数(head kidney somatic index,HKBI)和肝体指数(hepatosomatic index,HSI)均低于对照组(P＜0.05或P＜0.01),150 d时蚕豆组草鱼肝体指数与对照组无显著差异(P＞0.05);蚕豆组草鱼血清碱性磷酸酶、溶菌酶和补体C3(第30天除外)活性均低于对照组的,在转投喂饲料后,3种血清酶活性均出现回升趋势;与对照组相比,蚕豆组草鱼肠道菌群多样性降低,芽胞杆菌属(Bacillus)和鲸杆菌属(Cetobacterium)等有益菌数量减少,维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等条件致病菌数量增多.两组草鱼肠道核心菌群主要为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria).本研究结果提示,随着脆化时间的增加,摄食蚕豆改变草鱼肠道菌群组成、抑制血清酶活性和生长性能,在转投饲料后其肠道菌群、血清酶活性及生长性能均有所改善.本研究结果对脆肉鲩的健康养殖具有重要的科学指导意义.