高致病性禽流感H5疫苗对鹅的免疫原性初探

高致病性禽流感是一种传播快、危害大的一类动物疫病,严重危害畜牧业生产,严重威胁人民群众的安全。从最近一个时期国际国内疫情的发展趋势,从国际上流行情况看,高致病性禽流感疫情在我国周边国家和地区呈现大规模流行趋势,2003年末～2004年初越南、泰国等国暴发高致病性禽流感     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

【目的】 利用腺病毒AdMax系统表达载体表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,并研究其免疫原性。【方法】 参考GenBank中已公布的PRRSV N基因序列（登录号：KT945017.1）,人工合成PRRSV N基因,并将其连接至腺病毒穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建重组穿梭质粒pDC316-N。将重组穿梭质粒pDC316-N与AdMax腺病毒系统的骨架质粒PBHGLOX （delta） E1,3Cre共同转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-N,对获得的重组腺病毒液进行PCR和测序鉴定,用鉴定正确的rAd-N病毒液感染293A细胞,对该重组腺病毒进行扩大培养,检测病毒的TCID₅₀,并用RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的表达和反应原性。用重组腺病毒免疫小鼠,收集血清用PRRSV抗体检测试剂盒检测其抗体水平,初步评价其对小鼠的免疫效果。【结果】 PCR扩增出1条大小为400 bp的PRRSV N基因条带,测序结果正确,表明重组腺病毒构建成功,浓缩后测得其半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）为10^-10.239。RT-PCR和Western blotting检测结果证实目的基因在基因和蛋白水平上均可得到正确表达,蛋白分子质量约为14 ku。小鼠特异性抗体检测表明,重组腺病毒rAd-N免疫小鼠后可使小鼠快速产生PRRSV特异性抗体,与对照组差异显著（P<0.05）,其中重组腺病毒与Gel佐剂配合使用时效果最好,最高可达7.84 U/L。【结论】 本研究成功构建表达PRRSV N蛋白的重组腺病毒,其具有良好的免疫原性,为建立针对PRRSV抗体的间接ELISA检测方法和进一步研发PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

副猪嗜血杆菌病多价油乳剂灭活疫苗的研制

<正>猪的多发性浆膜炎和关节炎由副猪嗜血杆菌所致,其危害日渐严重[1]。该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。预防该病最为有效的方法之一是接种疫苗[2]。本试验以齐齐哈尔地区分离鉴定的副猪嗜血杆菌作为制苗菌株,研制成副猪嗜血杆菌病多价油乳剂灭活疫苗,经田间试验初步应用取得满意结果,现将结果报道如下。1材料1.1菌种由黑龙江省兽医科学研究所检验室分离鉴定和选育的毒力强、抗原性好、不同血清型的副猪嗜血杆     

鮰爱德华菌外膜微孔蛋白ompN1、ompN2和ompN3基因生物信息学分析及截段基因的原核表达与其抗原性检测

根据GenBank中鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)外膜微孔蛋白N(outer membrane porin protein,OMP)基因序列(NC_012779.2)设计引物,以鮰爱德华菌Ms12基因组DNA为模板,经PCR扩增后克隆至pMD19-T载体,将阳性克隆菌送公司测序。测序结果通过生物信息学软件对ompN1、ompN2和ompN3序列的氨基酸序列相对分子质量、分子式、信号肽、跨膜区、亲/疏水性、B细胞表位进行预测,并构建系统发育树;根据去信号肽的B细胞表位相对集中区域设计特异性引物,经PCR扩增后,将截段序列克隆至pMD19-T载体,鉴定成功后克隆至原核表达载体pET32a(+)并转化至BL21(DE3)/Rosseta(DE3)进行IPTG诱导表达,最后用兔抗鮰爱德华菌血清对重组蛋白OmpN1、OmpN2和OmpN3进行免疫原性检测。结果显示扩增得到ompN1(1 143bp)、ompN2(1 056bp)和ompN3(1 053bp)的序列,获得的基因登录号分别为KJ831564、KJ831565和KJ831566。经生物信息学分析显示,OmpN1、OmpN2和OmpN3蛋白分子式分别为C1940H2993N543O622S7、C1817H2723N497O579S5和C1896H2843N519O563S7,相对分子质量大小分别为44 100、40 900和41 800,均为含有1个信号肽和跨膜区的疏水性蛋白,具有1个革兰阴性细菌OM_channels超家族结构域,是1种嵌入型的膜外蛋白;SDS-PAGE电泳检测发现,诱导表达的融合重组蛋白均以包涵体的形式出现在沉淀中,大小分别约为61 800、58 700和59 100;Western-blot分析表明,重组蛋白OmpN1、OmpN2和OmpN3均能与兔抗鮰爱德华菌全菌血清结合,表明鮰爱德华菌外膜微孔蛋白N具有亚单位疫苗开发的潜力。     

兔瘟病毒VP60基因重组真核表达质粒的构建及其免疫原性

采用RT-PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体,获得重组质粒pMD19-T-VP60,并进行序列测定。测序正确的pMD19-T-VP60经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切后,将目的片段VP60插入真核表达载体pVAX-1,构建真核表达质粒pVAX1-VP60。将构建好的重组质粒pVAX1-VP60按500μg/只腿部肌肉注射25日龄家兔,同时设pVAX-1组、兔瘟组织灭活苗组和PBS组。分别于免疫后7,14,21,28,35,42 d对各组兔静脉采血,间接ELISA法检测血清中特异性抗体水平,结果显示PBS组和pVAX-1组未检测到特异性抗体,pVAX1-VP60组和兔瘟组织灭活苗组家兔都能产生高水平的特异性抗体,在特异性抗体水平高峰期,2组数据差异不显著(P0.05)。于免疫后3,7,14,21,28,35,42 d随机剖杀pVAX1-VP60组试验兔3只,取心、肝、脾、肺、肾、腿部肌肉,提取组织DNA,进行PCR检测,结果均检测到目的基因VP60的存在。免疫后28 d以滴度10~8的RHDV 0.5 m L/只腿部肌肉注射攻毒,pVAX-1组、PBS组、兔瘟组织灭活苗组、pVAX1-VP60组的相对保护率分别为0%,0%,90%,85%,表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。     

产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

Isolation and Identification of one Strain of H9 Subtype Avian Influenza Virus and Study on its Biological Characteristics

In 2013,one case of suspected H9 subtype avian influenza occurred in a chicken farm of Jilin povince.Clinical samples were collected from the diseased farm,inoculated into the allantoic cavity of 9-day-old SPF chicken embryo,and then one strain of virus was isolated.The results of HA test,HI test and molecular biology test all showed that the isolate belonged to H9 subtype avian influenza virus (AIV).The HA cleavage site of the isolate was RSSR↓GLF,which was consisted with the molecular characteristic of low pathogenic AIV.The HA peptide chain had 9 potential glycosylation sites which were same as other isolates of recent years.The isolate had 8 receptor binding sites,including 234 receptor binding site by glutamine (Q) mutating into threonine (T).The phylogenetic tree revealed the isolate belonged to Eurasian lineages and it had far genetic relationship with the earliest domestic isolate (A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)),but had close genetic relationship with the representative strain (A/Chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)) of major epidemic branch since 2007.We prepared an inactivated oil-emulsion vaccine of the isolate,and then vaccinated SPF chicken.21 days after vaccination,the HI titer of chicken serum antibody reached up to 10log2.The result suggested the isolate had good immunogenicity.     

伪狂犬病的防控

<正>伪狂犬病是危害养猪业最严重的传染病之一。该病在我国广泛存在,特别是从2011年10月以来,我国开始发生严重的伪狂犬病,引发巨大损失。伪狂犬病是危害养猪业最严重的传染病之一,引起巨大经济损失,西方养猪发达国家在20世纪90年代相继制定和启动了该病的根除计划,取得了很好的成效。该病在我国广泛存在并引发巨大损失,特别是从2011年10月以来,河南、山东、河北交界处开始发生严重的伪狂犬病,母猪、仔猪、育肥猪大批死亡,甚至猪场周边的犬猫也成批死亡。此后,伪狂犬病南下北上,东征西扩,蔓延到整个中国。     

C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位对PCV2 VLPs稳定性的影响

【目的】利用大肠杆菌原核表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及在其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap嵌合蛋白,对Cap蛋白形成的病毒样颗粒（VLPs）的稳定性、免疫原性以及C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位VLPs的热稳定性进行研究,为猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs疫苗的高效制备及基于Cap VLPs纳米骨架展示技术嵌合疫苗的开发奠定基础。【方法】采用分子生物学方法合成PCV2b型强毒株ZJ的cap基因,在其C-端插入PRRSV T细胞抗原表位T1、T2、T3、T4、T5,构建cap-T1～cap-T5基因;将cap及cap-T1～cap-T5基因与pET28a表达载体连接,构建重组表达载体,转染大肠杆菌ClearColi^TMBL21(DE3)进行诱导表达,并对表达产物的热稳定性及免疫效果进行检测。【结果】实现了Cap蛋白及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并成功观察到了VLPs;表达产物热稳定性分析显示,在60 ℃处理30 min条件下,Cap VLPs保持稳定,而C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的VLPs热稳定性大幅下降;小鼠免疫效果检测显示,Cap VLPs诱导产生了高水平特异性抗体,其中VLPs+佐剂S350组效果最好。【结论】利用大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白可高效自组装成耐热和高免疫原性的VLPs,但在Cap蛋白C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位后的嵌合VLPs组装效果和稳定性急剧下降,提示PCV2 VLPs作为纳米骨架用于传染病疫苗研发仍有较大局限性。