猪唾液素黏附素胞外区在PRRSV感染PAM细胞中的作用

采用新的试验方法制备出纯度较高的抗猪Sn的鼠纯化IgG,并证实此种抗体可以阻碍PRRSV感染PAM,为研究猪Sn各结构域的作用提供参考,为进一步研究PRRSV侵入宿主的作用机制奠定基础。本试验分8个片段克隆猪Sn胞外区功能结构域(第2~17结构域),并分别构建重组表达质粒,转化到BL21进行诱导表达。通过优化蛋白表达条件,制备其重组蛋白,将8种重组蛋白混匀后制成混合抗原(SnE)免疫小鼠以制备其多克隆抗体血清,用间接ELISA的方法检测高免血清的效价,分离并收集血清。采用硫酸铵盐析与DE-52离子交换层析相结合的方法提取并纯化血清,得到纯度较高的鼠抗猪SnE抗体。无菌灌冲猪肺脏收集原代PAM至24孔培养板中,培养6h后,用抗Sn150(第1结构域)、SnE和Sn150+SnE等抗原的鼠纯化IgG以及鼠阴性IgG和PBS分别处理PAM,1h后用200CID50PRRSV感染PAM,分别在感染24、48h后用已建立的PRRSV实时荧光定量PCR方法检测感染细胞的病毒拷贝数。结果显示,PRRSV感染24h和48h时后,鼠抗猪Sn150抗体组的PRRSV mRNA拷贝数与阴性IgG组相比较均差异较小(P0.05);而鼠抗猪SnE抗体和Sn150+SnE混合抗体组的PRRSV mRNA拷贝数均显著低于对应的阴性IgG组,且鼠抗猪SnE抗体组24h和48h时PRRSV mRNA拷贝数分别是阴性IgG组的0.75倍(P0.001)和0.74倍(P0.001),Sn150+SnE混合抗体组24h和48h时的PRRSV mRNA拷贝数分别是阴性IgG的0.83倍(P0.01)和0.76倍(P0.001)。结果表明,鼠抗猪SnE抗体和Sn150+SnE混合抗体封闭后PRRSV感染PAM的能力降低,且效果显著,提示PRRSV的吸附和内吞作用可能与pSn整个胞外区都有密切的关系。     

猪SENP1基因克隆、生物信息学分析与表达研究

试验旨在对猪SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease 1,SENP1)基因CDS区进行克隆和生物信息学分析,并探讨SENP1基因在乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染PK15细胞后的表达情况。根据GenBank中公布的猪SENP1基因预测序列(登录号:XM_013997974.2)设计特异性引物,通过RT-PCR和T/A克隆技术对猪SENP1基因CDS区序列进行克隆测序,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR分析猪SENP1基因在JEV感染PK15细胞不同时间点(0、12、24、36、48 h)的表达情况。结果显示,猪SENP1基因CDS序列全长2 034 bp,共编码677个氨基酸。序列比对和系统进化树分析结果表明,猪SENP1蛋白序列和山羊、犬、人、牛的相似性分别为94.8%、94.2%、93.9%和93.8%,说明在这些物种中SENP1的保守性较强;猪与犬的SENP1分子亲缘关系较近。生物信息学分析结果显示,猪SENP1蛋白相对分子质量为76 825.76,等电点为8.53,体外半衰期为30 h,不稳定系数为53.59,总平均亲水指数为－0.622。SENP1蛋白不含信号肽序列,无跨膜结构域。二级结构分析结果显示,SENP1蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占31.31%、46.68%、16.25%和5.76%。三级结构分析结果显示,猪SENP1蛋白中存在8个α-螺旋区和7个β-转角区。实时荧光定量PCR结果显示,猪SENP1基因在JEV感染的PK15细胞中呈现上调表达趋势,其中在感染后48 h SENP1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。本试验结果为后续深入研究SENP1基因功能提供了参考。     

水牛ASAH1基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛ASAH1基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制,采用RT-PCR及载体构建技术对ASAH1进行了研究。结果表明:水牛ASAH1基因的编码区全长993 bp,共编码330个氨基酸。多重序列比较分析显示水牛ASAH1核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、猪、马、人和非洲象相应序列的相似性分别为99%、97%、96%、90%、90%、89%和87%,结合系统进化树分析结果,ASAH1基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对ASAH1蛋白质的分析表明:该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于溶酶体,存在NAAA-beta和Ntn_AC_NAAA结构域。成功构建水牛ASAH1基因真核表达载体,转染293T和CHO细胞系后,均能够正确形成ASAH1-EGFP融合蛋白,产生绿色荧光信号。我们的结果为今后阐明ASAH1基因在水牛水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。     

入孵种鸭胚病毒性感染的检测及禽坦布苏病毒的分离鉴定

本研究应用RT-PCR技术对孵化过程中死亡的不同品种种鸭胚进行常见病毒感染检测。结果表明,死亡的种鸭胚感染病毒种类多达9种,且首次从鸭胚中检测到禽坦布苏病毒(ATV)感染,不同品种的种鸭胚病毒感染率差异较大,以种番鸭胚感染率最高达58.82%。ATV囊膜蛋白(E)基因分析表明,3株种鸭胚ATV分离毒(PT15-4株、FJFQLL36株和PT15-27株)与GenBank中已发布鸭源ATV囊膜蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分别在97.2%~99.8%及97.1%~99.4%之间,亲缘关系密切。动物试验表明,3株病毒对开产麻鸭的致病性不尽相同,其中PT15-4株和PT15-27株可引起麻鸭产蛋量显著降低及卵巢的出血病变,而FJFQLL36株病毒对麻鸭产蛋影响不明显,且未引起蛋鸭卵巢明显出血或卵黄液化病变。以上结果表明,我国种鸭胚中病毒性感染较为复杂,而且还出现了ATV的感染,尽管不同禽坦布苏病毒分离株间存在毒力差异,但均可从种鸭经卵传播到种蛋而成为新的传染源。     

气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank中气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的参考序列,采用PCR方法扩增细胞毒素CctA基因。在将该基因进行克隆和测序后利用生物信息学方法,对细胞毒素CctA蛋白的理化性质、结构功能域、蛋白质二级结构和三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与参考序列(JQ692583)相比,存在3处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为99.4%;CctA蛋白的理论等电点为8.00,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,主要有4个抗原表位区域。本研究为CctA蛋白功能的深入研究提供了参考,并为气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及合成肽疫苗的研发奠定了基础。     

提高FSH剂量对多次取胚羊产胚量的试验

胚胎移植技术在我国已经推广应用多年.为了更好的搞好这项工作,在胚胎移植工作进行的同时,利用朝阳市畜牧种业有限公司提供的萨福克绵羊作供体试验羊,进行了提高多次取胚羊（至少为3次或3次以上）FSH使用剂量,对胚胎生产数量影响的试验.试验充分表明,对多次取胚羊提高FSH剂量,可提高受体羊产生较多数量的胚胎,同时,提高FSH的剂量一定要适当.     

苦瓜转录因子McEIL2的克隆及其表达分析

本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

奶牛TNMD基因的克隆与原核表达

从奶牛组织中克隆Tenomodulin(TNMD)基因的cDNA序列,采用双酶切后连接表达载体pGEX-4T-1,转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达。结果表明,TNMD基因的序列全长为957 bp,通过双酶切构建的表达载体pGEX-TNMD在BL21大肠杆菌中成功表达了分子量为59.68 kDa的融合蛋白。