抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,epsps)是一个高抗草甘膦的基因,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1Ac M是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉米,本研究构建出质粒p CAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1Ac M-Tnos,通过农杆菌(Agrobacterium tumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))试验筛选出转基因株系,在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析,并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系,这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述,将改造后的Bt抗虫基因cry1Ac M和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米,赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性,为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。     

利用葡萄糖、木糖生产燃料酒精的基因工程菌构建

以运动发酵单胞菌的总DNA为模板，PCR扩增Zymomonas mobilis中的乙醇脱氢酶基因（adhB）和丙酮酸脱羧酶基因（pdc）。首先进行单个基因表达，基因表达产物经SDS—PAGE电泳分析和乙醛指示平板检测，确认有酶活性后，将这2个基因串联构建多顺反子表达质粒pSE—pdc—adhB，转入大肠杆菌DH5a内，得重组工程菌株。工程菌株经IPTG诱导，分别在含10％葡萄糖和10％木糖培养基中于37℃培养72h，有乙醇产生，酒精产率分别为对照菌株21倍和5倍。     

大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(PEPP)研究:I.对非生物胁迫的反应

对缺磷、铝毒、盐、干旱、Fe、Mn、Cu、Zn胁迫下大豆根系和叶片磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(PEPP)活性进行了测定,结果表明:(1)长期缺磷和铝毒胁迫可显著提高大豆根系的PEPP活性,并表现出加成效应;(2)长期铝毒、缺磷和铝毒耦合胁迫也显著提高大豆敏感品种BL2叶片的PEPP活性;(3)盐胁迫、干旱以及长期Fe、Mn、Cu、Zn过量都显著提高大豆根系的PEPP活性,Fe、Cu、Zn缺乏则对根系和叶片的PEPP活性影响不大,长期缺Mn显著降低大豆根系及叶片的PEPP活性。     

稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析

为揭示C₄野生植物稗草（Echinochloa crusgalli）PEPCase的结构和功能特点,探索改善作物高光效新途径,本研究首次克隆了稗草（E. crusgalli）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA全长,测序及同源性比较分析结果证实,稗草ppc的cDNA全长为2 886 bp,编码961个氨基酸（GenBank登录号：AY251482）;核苷酸序列与谷子(Setaria italica)C₃型、高粱(Sorghum bicolor) C_3-2型、玉米(Zea mays) C_3-2型、水稻(Oryza sativa)C₃型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的同源率分别达94.8%、93.2%、93.0%和89.7%。推导的氨基酸序列中C末端第771位氨基酸是丙氨酸（A）,表明是一个C₃型基因。与其他植物几种不同形式PEPCase进行的多重序列比对与系统进化分析结果也证实,此基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与所有参与对比的C₃型序列的同源性均远远高于与C₄型的同源性。与玉米、高粱C_3-2型PEPCase的同源性分别高达到96.5%、96.4%,与高粱、玉米的C_3-1型PEPCase的同源性分别为84.3%、83.8%,而与谷子、玉米、甘蔗和高粱的C₄型PEPCase的一致性相对较低,分别为82.2%、79.1%、77.1%、76.6%。因此进一步推论新克隆的稗草ppc基因属于C_3-2型。对其编码的蛋白序列进行了结构域、活性位点和功能位点预测。     

谷子丙酮酸磷酸双激酶基因(SiPPDK1)对非生物逆境的响应

通过序列比对在谷子基因组中鉴定出一个PPDK基因,命名为Si PPDK1。为揭示该基因对逆境胁迫的响应,本研究通过对Si PPDK1的基因结构、蛋白特征、功能、启动子区域顺势元件、亚细胞定位、进化特征等进行了系统的分析和预测。荧光实时定量PCR检测了该基因在苗期不同逆境、关键生育期干旱以及不同光照条件下的表达。结果表明该基因位于谷子9号染色体,含有17个内含子,有2个可变剪切。功能域分析和多序列比对发现Si PPDK1蛋白具有非常保守的序列结构,并且与其它植物PPDK蛋白非常相似。q RT-PCR表达谱分析表明Si PPDK1基因在苗期被PEG、ABA、Na Cl和低温胁迫强烈诱导。进一步研究表明Si PPDK1基因在拔节、抽穗和灌浆期干旱和不同光照强度条件下均参与了对干旱和光照的胁迫响应,推测该基因参与了谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期干旱和光照胁迫应答中起重要作用。     

苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（PEPCKs）的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica Borkh.）多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1和MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、模拟干旱（PEG）、高温（40℃）和低温（8℃）处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因（MdPCK1和MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965）,其开放阅读框（open reading frame,ORF）分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,MdPCK1和MdPCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1和MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1和MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100 μmol·L^-1 ABA和100 g·L^-1 PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 ABA、100 g·L^-1 PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1和MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1和MdPCK2表达。     

甘蓝型油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究分析

为了解甘蓝型油菜(Brassica napus)中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的表达和分布情况,文章首先分析了油菜和拟南芥中PEPC基因之间的关系,同时参照拟南芥中4条PEPC基因扩增了针对甘蓝型油菜的探针,Southern blot结果表明,甘蓝型油菜中PEPC基因肯定多于4条,而RT-PCR分析了不同时期种子中的PEPC基因的表达情况,表明PEPC基因在种子成熟过程中油脂、储藏蛋白质等贮存物质的积累有一定作用。     

锰对雏鸭免疫参数及生化指标的影响

锰是动物的必需微量元素之一。它是许多酶的激活剂（如丙酮酸羧化酶、精氨酸酶等），参与多种代谢活动。当动物缺锰时，会出现生长受阻、骨骼畸形、生殖机能障碍、新生动物运动失调等。鸭等家禽，尤其是肉用雏鸭，对锰的需要量比哺乳类动物要高，     

菠萝果实发育过程中有机酸含量及相关代谢酶活性的变化

以菠萝品种卡因为试验材料,测定了不同发育时期果实中有机酸含量及其有机酸代谢相关酶—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、柠檬酸合成酶(CS)的活性变化,并对果实中酸积累与酶活性的关系进行了分析。结果表明,卡因菠萝果实中所含有机酸有柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙酸、草酸、马来酸,其中主要有机酸为柠檬酸(约占62%)、其次为苹果酸(约占14%)、酒石酸、乙酸和草酸的含量较低,马来酸微量。随着果实的发育,柠檬酸含量呈低-高-低的变化趋势,苹果酸、草酸、乙酸、酒石酸含量均呈下降趋势,柠檬酸在果实成熟时占主要优势,是果实主要的有机酸。在幼果期到果实迅速生长后期(花后10～70d),柠檬酸合成酶(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性与柠檬酸含量呈显著正相关。进入果实青熟期(花后90d)后,果实柠檬酸含量变化与PEPC和CS活性并无明显联系,此期酸积累不仅仅依赖这些酶的活性水平,还与其他因素有关。     

pfl-act基因在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

丙酮酸甲酸裂解酶是肠道细菌在厌氧代谢中十分关键的酶,丙酮酸甲酸裂解酶激活因子(pyruvateform ate lyase activator,PFL-A)在功能上具有重要的作用。为进一步研究PFL-A的激活机理,以大肠杆菌K-12的基因组为模板,通过G enB ank上公布的序列设计引物,扩增出目的基因,克隆到pM D 18-T载体,经测序,所扩增出的基因与p f l-act基因具有99%的同源性。将p f l-act连接到高效表达载体pET-22b( )中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,结果发现,p f l-act以包涵体形式表达。改变诱导剂、诱导剂量或培养温度,对包涵体的形成均没有明显的影响。