水稻丙酮酸脱氢酶激酶1多克隆抗体的制备

水稻丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)基因位于水稻基因组的第7条染色体上,其cDNA全长为1 498 bp,编码有363个氨基酸残基的多肽链,主要在叶片中表达。为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,本研究构建水稻PDK1的原核表达载体,重组质粒转化大肠杆菌诱导表达,得到分子量大概在41 ku的重组蛋白,经纯化后免疫新西兰大白兔成功制备水稻PDK1多克隆抗体。     

热休克蛋白对枯草芽孢杆菌抗逆性和乙醇产量的影响

[目的]研究热休克蛋白对增强枯草芽孢杆菌的抗逆性和增加乙醇产量的影响。[方法]运用基因工程技术,用大肠杆菌的Lac启动子、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因(pdc)和乙醇脱氢酶基因(adhB),构建在枯草芽孢杆菌中表达的BLAP操纵子,BLAP操纵子导入枯草芽孢杆菌可使其发酵糖生产乙醇。然后用超嗜热菌强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的小分子热休克蛋白基因(sHsp)构建在枯草芽孢杆菌中表达的BLAPH操纵子。[结果]成功地构建了能表达小分子热休克蛋白,产生乙醇的枯草芽孢杆菌。[结论]小分子热休克蛋白的表达,使枯草芽孢杆菌在致死温度下的存活率显著提高,对温度及乙醇的耐受性显著增强。同时枯草芽孢杆菌的乙醇产量显著提高。     

丙酮酸肌酸对肉鸡脂肪代谢和蛋白质代谢的影响

300羽1日龄雄性AA肉鸡随机分为4组,每组3个重复,每个重复25羽。分别于基础日粮中添加质量分数为1%、5%和10%丙酮酸肌酸(CrPyr),以不添加CrPyr为对照,饲喂至42日龄时各组每个重复分别随机宰杀4只,采集血样、肝脏、腹脂、左侧胸肌和腿肌,测定血清葡萄糖(BG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、肌酸激酶(CK)、尿酸(UA)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、胰高血糖素、胰岛素和瘦素含量,以及肌肉核酸和蛋白质含量。结果表明:与对照组相比,CrPyr显著降低肉鸡腹脂率及肝脏和血清中TG、LDL-C、UA含量,但增加血清FT3含量;CrPyr明显提高胸肌率、腿肌蛋白质含量及RNA/DNA值;同时CrPyr还提高了肌肉胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)和生肌调节因子的mRNA转录水平。提示:CrPyr可通过提高肉鸡体内脂类分解代谢相关酶活性及激素水平,对脂肪代谢起调节作用;同时通过促进蛋白质的沉积,提高肌肉蛋白质含量,促进肌肉生长。     

具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因的克隆及序列结构与表达研究

丙酮酸脱氢酶(PDH)是丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中的前件酶,参与生成柠檬酸循环(TCA)的起始物乙酰辅酶A,决定生物体内营养成分的分配。利用电子克隆、RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了与果蝇lethal(1)G0334基因类似的具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因。Bm-l(1)基因的cDNA全长为1 630 bp,由1 200 bp的完整ORF序列、186 bp的5'-UTR和207 bp的3'-UTR组成,含8个外显子和7个内含子,编码蛋白为399个氨基酸残基,分子质量43.93kD,pI 8.07。Bm-l(1)基因编码蛋白的69-365氨基酸残基为E1-dh结构域,该结构域为硫胺素焦磷酸依赖性脱氢酶所特有。蛋白质二级结构预测结果表明α螺旋占28.8%,β折叠占12.0%。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(1)基因编码蛋白与赤拟谷盗等昆虫的PDH具有63%以上的序列相似性,且保守区域高度一致。Bm-l(1)基因mRNA在家蚕整个卵期、幼虫期、蛹期和刚羽化的成虫中,以及5龄3 d幼虫的头部、丝腺、生殖腺、脂肪体、中肠和血液6种组织中都有较高的转录水平,且存在较小的组织差异性。     

盐酸咪唑苯脲W/O型乳剂的处方工艺筛选

摘要：本试验旨在筛选盐酸咪唑苯脲W/O型乳剂的基础处方。采用单因素分析方法对油相、乳化剂的种类及用量、油水比例进行筛选以及采用正交试验对处方工艺进行优化;确定了盐酸咪唑苯脲W/O型乳剂的基础处方,最终筛选出白油为最佳油相、亲水性乳化剂OP-10为最佳乳化剂,初步确定白油、亲脂性乳化剂司盘-80、亲水性乳化剂OP-10为最佳处方组合,乳化剂的最佳用量为处方量的10%,油水最佳比例为7：3。确定最佳乳化温度为50℃,最佳乳化时间为3min,最佳乳化速度为8000r/min。通过上述处方筛选及工艺优化,制备了2%的盐酸咪唑苯脲W/O型乳剂。     

蜀恢881含玉米C4型pepc基因改良系的遗传背景及其光合特性

从通过分子标记辅助选择育成的含玉米C4型pepc基因蜀恢881中筛选10株,利用530对SSR引物进行遗传背景分析,发现与蜀恢881表现差异的位点仅有1～4个,相似度在95.15%以上,最高的达9903%。进一步对相似度为9903%的转育玉米C4型pepc基因蜀恢881的6个生长时期测定有关光合指标,表明6个时期的PEPC酶活性均比蜀恢881增强,PEPC酶活性值最大时期是拔节期,为1264.2 μmol/(mg·h）,分蘖初期增加的幅度最大达到23.3倍;其净光合速率与蜀恢881相比,在分蘖初期、分蘖盛期、拔节期和始穗期都得到不同程度的提高,其中拔节期最高,达到22.3%。研究表明通过杂交利用C4型pepc基因特征引物对C4型pepc基因进行分子标记辅助选择,能够获得携有C4型pepc基因且与受体亲本遗传背景十分接近的籼型水稻材料,而且C4型pepc基因在新的遗传背景下能够高水平表达和稳定地遗传。据此,建立了分子标记辅助选择、光合生理生化指标鉴定和田间综合农艺性状考查相结合的筛选玉米C4型pepc基因水稻的技术体系;同时认为在拔节期进行转育C4型pepc基因水稻光合生理指标的测定和筛选的效果可能较理想。     

3-溴丙酮酸对美国白蛾核型多角体病毒的增效作用

目的 利用3-溴丙酮酸（3-BrPA）作为美国白蛾核型多角体病毒（HycuNPV）的生物增效剂,探讨3-BrPA对HycuNPV的毒力和对美国白蛾生长发育的影响,为进一步推进HycuNPV杀虫剂的应用提供新的增效剂。 方法 通过室内在HycuNPV中添加不同剂量3-BrPA,分析其对HycuNPV的增效作用以及对美国白蛾生长发育的影响。 结果 室内生物活性结果表明,3-BrPA对HycuNPV具有增效作用,不仅可以提高HycuNPV的感染能力,还能提高杀虫速度。当3-BrPA的添加剂量为5.0、10.0和15.0 mg·g−1时,HycuNPV作用于美国白蛾3龄幼虫的LC50都有不同程度地降低;并且对HycuNPV的增效倍数（SR）分别为825.14、164.72和0.47,共毒系数（CTC）分别为82 613.63、16 579.25和147.27。不同浓度的HycuNPV在不同剂量的3-BrPA作用下,其杀虫效果各不相同。添加不同剂量的3-BrPA,LT50缩短了3.280～9.724 d。根据SR、CTC、LT50及ST等指标评判,在浓度为9.0 × 105 OBs·mL−1的HycuNPV中添加5.0 mg·g−1的3-BrPA时,增效作用最优。此外,3-BrPA和HycuNPV联合作用还显著抑制了幼虫的生长发育,且存活幼虫的化蛹率和羽化率均低于单独使用病毒杀虫剂。 结论 3-BrPA对HycuNPV具有增效作用,有望作为理想的病毒杀虫剂的增效剂。     

胰岛素对犊牛肝细胞PC mRNA表达及其活性的影响

取单层培养72 h生长良好的犊牛肝细胞,采用单因素重复试验,分别添加0,5,10,20,50,100μmol/L的胰岛素(Insulin,INS),每个处理3个重复(每重复2孔),再培养12 h后分别提取RNA和制备细胞上清液。应用荧光定量PCR方法检测外源INS对肝细胞糖异生关键酶丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PC)基因表达的影响,同时用比色法检测其对肝细胞PC活性的影响。结果表明,一定浓度的INS显著抑制了肝细胞PC mR-NA表达,降低了PC活性。     

嗜热芽孢杆菌丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达纯化及活性分析

偶联法测定酶的活性是常用酶活测定方法之一。核苷二磷酸(NDP)是核苷三磷酸的β,γ高能磷酸键水解产物之一,丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)是用来测定NDP生成的常用偶联酶。为了分析嗜热菌苍白空气芽孢杆菌(Aeribacillus pallidus JH-7)(最适生长温度为50℃)的PK和LDH是否可以作为50℃条件下的偶联酶,研究从Aeribacillus pallidus JH-7基因组中克隆pk和ldh,连接到表达载体pET24a。结果表明,经诱导表达、纯化得到纯度达95%以上的Ap PK和Ap LDH。并利用分光光度法,分别对Ap LDH和Ap PK的动力学常数及催化效率进行了分析。结果表明,Ap PK对NDP的最适底物为ADP,催化效率为5×104 mol/(L·s),最适p H值为8.0,最适温度为45℃;NADH为Ap LDH的最适底物,催化效率为3.7×105 mol/(L·s),最适pH值为5.8,最适温度为35℃。虽然50℃不是Ap LDH和Ap PK的最适温度,但它们在此温度下的kcat分别为16.4,64.5 s-1,暗示它们可以作为此温度下的偶联酶。     

单倍体酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因(pdc1)的敲除与鉴定

为了抑制单倍体酿酒酵母H14的副产物乙醇的合成,使得2,3-丁二醇产量的提升。利用基因工程手段构建载体pWCL-pdc1,获得两端含40 bp pdc1的同源重组片段-loxP-kanMX-loxP。利用Cre/loxP技术获得pdc1缺失菌株S. cerevisiae H14-01 (△pdc1)。并以野生型菌株S. cerevisiae H14为对照,进行摇瓶发酵试验。S. cerevisiae H14-01长势明显略低于原始菌株。在整个发酵期间,2,3-丁二醇的最高产量和转化率分别为0.373±0.016 g/L和0.005 g/g,分别较原始菌株提高了37.30%和4.66%,但原始菌株没有检测到乙偶姻和2,3-BD生成。另外S. cerevisiae H14-01的乙醇转化率降低了33.24%,但甘油产量提高了15.76%。说明了碳流流向乙醇被阻断之后,会增加2,3-丁二醇的产量,同时会使此部分碳流流向甘油。因此,并为进一步获得高产2,3-丁二醇的工程微生物群体奠定了基础。