长链寡核苷酸生物合成方法的研究

化学合成长链寡核苷酸面临许多困难，研究通过对长链寡核苷酸生物合成方法的研究，成功合成并纯化了长链寡核苷酸，其长度达到146nt，并且其序列没有错误。生物合成的基本方法是：首先用一对PCR引物扩增DNA模板，     

大鲵蛙病毒LAMP检测方法的建立

根据大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)主要核衣壳蛋白MCP编码基因的序列设计合成4条特异性引物,以重组pMD19-T-MCP质粒为模板,通过反应条件与反应体系优化,建立CGSRV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定LAMP对CGSRV的最低检测限,并与巢式PCR和普通PCR进行比较。结果表明,该LAMP方法最佳反应温度为62℃,反应时间为40min,对CGSRV最低检测限5copies/μL,而巢氏PCR和常规PCR的检测限为50和5×103copies/μL,表明该LAMP方法的灵敏度显著高于巢氏PCR和常规PCR;且与淋巴囊肿病毒、鲫鱼出血病疱疹病毒2型、云斑尖塘鳢虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、迟钝爱德华菌、嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌等均无交叉反应;反应结束后加入荧光染料EtBr可肉眼判定粉色为阳性,而棕色则为阴性。因此,该方法对CGSRV的检测较巢氏PCR和常规PCR更为简便、快速、灵敏、特异,且不需昂贵仪器设备,更适合养殖现场检测,为CGSRV早期感染的快速检测提供了新方法。     

马立克疫苗的质量检测及其对鸡源食品安全的影响分析

山东某种鸡场7个父母代鸡群应用2个批次马立克（MD）CVI988/Rispens疫苗免疫后仍发生疑似MD病。本研究对其送检的3瓶MD苗（2个批次，编号为F11、F21、F22，其中F21、F22为同一批次）进行了毒力测定及禽白血病病毒（ALV）的检测。结果显示：MD疫苗F11、F21、F22的毒力检测结果分别为800PFU/羽份、1300PFU/羽份、1480PFU/羽份，3瓶疫苗的毒力均低于国家兽医药典规定2000PFU/羽份的标准，F11低于OIE规定不少于1000PFU/羽份的标准；3瓶MD疫苗冻融后上清和细胞培养上清的p27抗原均为阳性；3瓶疫苗均检测出E亚型ALV（ALV-E）的囊膜蛋白（env）基因（PCR方法扩增2400bp片段，包括LTR序列），与经典ALV-E株RAV-0（E）、SD0501（E）的同源性为98.9%-99.4%。本研究发现，送检的3瓶2个批次MD疫苗存在毒力不足和内源ALV污染的质量问题，有可能是该种鸡群发生疑似MD病的原因之一。     

重叠延伸 PCR 法克隆蓖麻蚕β-FFase 同源基因

本研究利用重叠延伸PCR 的方法成功获得蓖麻蚕两个β-FFase 基因ScSuc1和ScSuc2全长ORF，为今后研究ScSuc1和ScSuc2的体外表达以及分析酶活特征奠定了必要的实验基础。     

蓝光对滇重楼生长及光合作用的影响

[目的]研究不同波长(410、440、450、460和485 nm)蓝光对滇重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)生长及光合作用的影响。[方法]以3年生滇重楼种苗为试材,测定不同波长蓝光处理3个月后的光合参数、叶绿素荧光参数及生长指标等。[结果]410和485 nm蓝光处理下滇重楼潜在光合能力和长势较差,440 nm蓝光处理下净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)和蒸腾速率(T_r)均最高,全株鲜质量较初始鲜质量增加比例最高,而胞间CO_2浓度(C_i)较低,且光系统Ⅱ的最大光合效率(F_v/F_m)低于正常范围,非光化学猝灭参数(NPQ)较低,说明该波长蓝光处理对滇重楼造成光胁迫;440 nm蓝光处理下滇重楼叶绿素a及叶绿素(a+b)含量均最高,叶绿素b含量较高,仅次于450 nm蓝光处理。[结论]440 nm蓝光处理下滇重楼叶片光合能力较强,有利于其鲜质量增加和光合色素含量的累积。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

鱼肠道弧菌免疫检测方法的研究

采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。     

H7亚型禽流感病毒核酸标准品制备及双探针荧光RT-PCR检测研究

从禽流感病毒A/Chicken/1/2002(H7N1)核酸中扩增了完整HA的基因编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备c RNA。用RNA保存液稀释至含量约108Copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过8家实验室联合定值,取平均值作为定值结果;经统计分析计算了该标准品的不确定度。此外,采用Taq Man方法,根据禽流感病毒H7亚型的血凝素基因的末端,采用1对引物和2条MGB探针,建立了禽流感病毒H7亚型Taq Man荧光RT-PCR快速检测技术。应用建立的方法对研制的标准品进行检测,检测限可达10基因拷贝;对新城疫病毒及其他亚型的流感病毒核酸进行检测,结果表明,建立的方法特异性良好,而且双探针的设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。     

基于Fiber1基因分型的安卡拉病毒感染病例实验室检测

为确诊贵州省某养鸡场发生疑似安卡拉病毒感染的病例,实验基于安卡拉病毒Fiber1基因设计合成引物,对病料样本进行病原核酸检测和核酸测序与序列分析。结果:(1)从病例的肝脏样本中扩增出大小约1 296 bp的Fiber1基因目的片段,与预期结果相符。(2)序列测定与分析显示,扩增的Fiber1基因序列与国内分离株序列同源性高,亲缘关系近。(3)系统进化分析显示,感染病例中的安卡拉病毒流行株(命名为:GZ-LPS)与K31、MX-SHP9、ON1和河北、江苏等地的FAdV-4分离株处于同一进化分支,而与其他血清型禽腺病毒株处于不同进化分支。结论:此次疫情经实验室诊断,确定为禽腺病毒Ⅰ群C种血清4型的安卡拉病毒感染所致。