表达猪瘟兔化疫苗株E0蛋白的PK-15细胞系构建

将克隆到pGEM T-easy载体中的E0基因双酶切回收后，连接到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中，利用Lipofectamine^TM2000将重组子转染PK-15、BHK-21、VERO 3种细胞，直接在荧光显微镜下用蓝光激发进行观察，在3种细胞中都可以观察到绿色荧光，而且在转染后的24、48、72 h 3个时间点上，观察到的荧光细胞数量逐渐增多，在72 h时荧光细胞的数量在3种细胞中都达到最多，总的来看，在PK 15中荧光细胞的数量最多。通过对细胞荧光的定位发现，重组质粒的荧光主要分布在胞浆内，而且细胞核周围的荧光较强，胞核与胞浆的界限明显，尤其是在PK-15细胞和VERO细胞中这种现象尤为明显。未携带E0目的DNA的pEGFP-N1 Vector转染3种细胞后，都可以观察到绿色荧光，但是整个细胞中是均匀出现荧光的。经酶切、PCR、单抗间接免疫荧光检测，PK-E0细胞中有大量的HCLV的E0表达，单纯的PK-15细胞中没有E0的表达。HCLV株在PK-E0细胞中从48h开始到72h的滴度比在PK-15细胞中的滴度要高。证明PK-E0细胞中E0蛋白的大量表达增加了HCLV在细胞中的复制。     

猪捷申病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立可同时检测猪捷申病毒（PTV）与猪圆环病毒2型（PCV2）的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187bp（PTV）、120bp（PCV2）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2．8×10^-2ng和6．6×10^-3ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23％,PCV2阳性率为38％,PTV与PCV2共感染率为16％。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。     

农杆菌介导香菇URA3基因RNAi体系构建

选择香菇(Lentinula edodes)内源乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶基因(URA3)为沉默靶基因,以其功能结构保守区域451～884 bp处的反向互补序列为干扰片段,将pCAMBIA1390改造为发卡结构载体HpV、GPiE改造为双启动子载体DpV-2.采用农杆菌介导转化法侵染小米粒培养基培养的香菇菌丝,通过...     

塞内卡病毒和口蹄疫病毒二重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为了建立一种快速、敏感、特异的能够鉴别诊断口蹄疫病毒(FMDV)和塞内卡病毒(SVV)二重实时荧光RT-PCR方法,根据FMDV及SVV的保守基因序列,设计了2套特异性引物和不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV和SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对二重实时荧光RT-PCR检测方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对98份疑似FMDV和SVV感染的临床样品进行了检测。结果显示,成功建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,模板在10~1～10~7拷贝/μL有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV和pGEM-T/SVV重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线,方法特异性较好;最低检测模板浓度为10拷贝/μL;自98份疑似FMDV和SVV感染样品中检出9份FMDV阳性,10份SVV阳性,2份FMDV和SVV双阳性,并且和克隆测序结果一致。本研究建立的FMDV及SVV二重实时荧光RT-PCR检测方法,可用于FMDV和SVV的快速鉴别检测,为FMDV和SVV的鉴别诊断提供特异、敏感和高通量的方法。     

猪CACNA1S基因的多态性与胴体及肉质性状的相关分析

以金华猪（40头）、皮特兰猪（30头）及其杂交产生的金皮F2代资源猪群（126头）为材料,对钙离子通道主亚基α1的编码基因（CACNA1S）第44外显子A187G突变、第37内含子A37G突变、T179C突变作PCR—RFLP检测（内切酶依次为Cfr42Ⅰ、XbaⅠ、Eco72Ⅰ）,分析其对胴体及肉质性状的遗传效应。结果表明：酶切位点Eeo72J的AA基因型对眼肌面积和肉色（L）存在极显著影响（P〈0．01）,BB基因型对后腿肌肉重存在极显著影响（P〈0．01）和大腿pH存在显著影响（0．01〈P〈0．05）;位点Xba Ⅰ对背膘厚（中）存在显著影响（0．01〈P〈0．05）,但AA、AB、BB基因型间效应差异不显著（P〉0．05）;位点Cfr 42Ⅰ仅在金华、皮特兰纯种猪群中存在多态性,而在屠宰猪群金皮F2代则表现为BB单态型。     

实时荧光定量PCR技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种高度接触性传染病,尤其是对母猪,该病毒严重影响其繁殖性能。实时荧光定量PCR以其快速、可靠的诊断技术,为检测和诊断PRRSV开辟了新方法。文内对国内外实时荧光定量PCR技术在PRRSV研究中的应用作了综述。     

大肠杆菌β-内酰胺酶耐药基因blaTEM,blaSHV,blaCTX-M三重PCR检测方法建立

本研究以我国大肠杆菌中常见的3种β-内酰胺酶耐药基因(bla,TEM blasHV和blaCTX-M)作为目的基因,设计3对特异性引物,建立了blaTEM,bla SHV和blaCTX-M耐药基因三重PCR检测方法.三重PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2.5 μL,dNTP (2.5 mmol/L)4 μL,blaTEM,blasHV和blaCTX-M上下游引物(25 μmol/L)分别为0.25 μL、0.5 μL、1.0μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4μL,模板2.5μL,反应总体积为25 μL.反应参数为:94℃5 min,94℃50 s,55℃55 s,72℃1 min,32个循环,72℃延伸5 min.本方法的建立为大肠杆菌中β-内酰胺酶耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段.     

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因，将PCR产物用K pn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后与同样处理过的pBAD／g ⅢB载体连接，转化TOP10细胞后挑取阳性克隆，酶切鉴定和测序后，用L-阿拉伯糖诱导，经SDS-PAGE和Western-blotting分析，表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达，表达的多肽为28 ku。     

用卡片PCR法检测卡耶他环孢子虫

使用FTA卡片法提取卡耶他环孢子虫DNA,利用特异性引物组F1E/R2B、CC719/CRP999进行巢式PCR,得到1条298bp的特异条带。并以柔嫩艾美尔球虫、贝氏隐孢子虫等作为对照,结果显示,除卡耶他环孢子虫外,均无特异性条带。用卡耶他环孢子虫卵囊进行巢式PCR敏感性试验,结果显示敏感度最高达1.0×100个/mL。